第一部分原发性皮肤黑色素瘤中表皮常驻的朗格汉斯细胞和单核来源的朗格汉斯细胞在不同时期的数目和分布目的:黑色素瘤免疫抑制性肿瘤微环境能促进肿瘤的侵袭和转移。表皮中的朗格汉斯细胞（LCs）能有效地提呈抗原并诱导T细胞应答。近年来发现,在表皮炎症时,单核细胞会被募集到表皮中,并分化为LCs,即为单核来源的LCs（moLCs）。moLCs能通过发挥促炎的作用从而促进银屑病进展。有研究表明黑色素瘤上方的LCs显著减少,且其存在与黑色素瘤患者较好的预后有关。这提示LCs可能对形成有效的抗黑色素瘤免疫非常重要。但部分研究发现原发性黑色素瘤中的LCs明显多于痣或正常皮肤。并且目前的研究尚未区分黑色素瘤中不同的LCs亚群。因此,深入分析不同LCs亚群在黑色素瘤中的数目和分布随肿瘤浸润程度的变化,将为研究LCs在黑色素瘤中的作用提供方向。方法:将C57小鼠正常皮肤中LCs和黑色素瘤中的LCs进行对比,用流式细胞术确定肿瘤中的LCs亚群。然后分别于肿瘤接种后第10、14和18天检测黑色素瘤中的表皮常驻的朗格汉斯细胞（rLCs）和moLCs的比例变化。于肿瘤接种后第0、3、6、10、14和18天检测肿瘤引流淋巴结中rLCs和moLCs的比例变化。免疫荧光检测rLCs和moLCs在肿瘤中的分布。免疫组化检测不同T分期黑色素瘤中rLCs和moLCs的数目及瘤内和瘤周的分布变化。结果:（1）在小鼠黑色素瘤模型中,不同类型的LCs亚群在黑色素瘤不同时期的比例和分布①小鼠黑色素瘤存在 rLCs（CD45+Langerin+CD11b+XCR1-Ly6C-）和 moLCs（CD45+Langerin+CD11b+XCR1-Ly6C+）两群细胞。②小鼠黑色素瘤中rLCs主要位于肿瘤上方表皮中,moLCs主要位于肿瘤真表皮交界处。③随着肿瘤进展,小鼠黑色素瘤中rLCs 比例逐渐下降,moLCs 比例逐渐增加。TDLNs中LCs随肿瘤进展先增多后减少,rLCs的比例占90%。（2）在人皮肤黑色素瘤标本中,不同LCs亚群在患者不同阶段的数目和分布①人皮肤黑色素瘤中同时存在moLCs和rLCs。两者皆主要分布于肿瘤周边的皮肤中,而肿瘤中央很少见。rLCs主要分布于表皮,而moLCs主要分布于真表皮交界处。②随肿瘤T分期进展,瘤内上方表皮rLCs有减少趋势,瘤周上方表皮rLCs先增多后减少。在肿瘤T1期,瘤内上方表皮rLCs显著多于瘤周上方表皮rLCs;而在T2-T4期,瘤内上方表皮rLCs显著少于瘤周上方表皮rLCs。有溃疡的黑色素瘤中的rLCs主要分布于瘤周上方表皮侧。③随肿瘤T分期进展,瘤内和瘤周moLCs都逐渐增多,但更多的分布于瘤周真表皮交界处。结论:（1）人和小鼠黑色素瘤中存在两种LCs亚群—rLCs和moLCs。（2）随肿瘤进展,rLCs的比例减少,moLCs的比例增加。（3）在人薄黑色素瘤中,rLCs主要分布于瘤内上方表皮。而在中等厚度以上的黑色素瘤中,rLCs主要分布于瘤周上方表皮。（4）moLCs在瘤内和瘤周都明显增多。rLCs和moLCs 比例和分布的变化提示它们在黑色素瘤中可能有不同的功能。第二部分清除小鼠表皮常驻的朗格汉斯细胞或单核来源的朗格汉斯细胞双向调控皮肤黑色素瘤的生长和免疫微环境目的:黑色素瘤中LCs的存在与患者较好的预后有关。然而目前的研究表明黑色素瘤及前哨淋巴结中的LCs可能存在表型和功能的缺陷,从而触发和维持高度的肿瘤免疫抑制性的微环境。且目前尚无研究报道moLCs在黑色素瘤中的作用。LCs在组织学上是来自胚胎卵黄囊和胎肝的组织常驻巨噬细胞。有文献报道胰腺癌中的组织常驻的巨噬细胞和单核来源的巨噬细胞能通过不同的功能促进肿瘤进展。结合第一部分rLCs和moLCs在黑色素瘤中的数目和分布特点,我们猜测黑色素瘤中rLCs和moLCs可能也通过不同的机制在黑色素瘤进展中发挥促肿瘤或者抗肿瘤的作用。方法:利用muLangerin-DTR-EGFP小鼠和抗CSF1R单克隆抗体模型清除小鼠表皮rLCs观察黑色素瘤生长和免疫微环境的变化。muLangerin-DTR-EGFP小鼠接受白喉毒素腹腔注射后可以清除表皮中Langerin+rLCs和真皮中Langerin+DCs,但Langerin+DCs于一周后便可由外周血中DCs前体补充而逐渐恢复。在Langerin+DCs恢复而rLCs仍缺乏的窗口期接种B16黑色素瘤细胞来探索rLCs清除状态对黑色素瘤生长及免疫微环境的影响。腹腔注射抗CSF1R单克隆抗体可清除清除单核、巨噬细胞和rLCs等细胞。于一周后单核及巨噬细胞基本恢复后接种B16黑色素瘤细胞,来探索rLCs清除状态对黑色素瘤生长及免疫微环境的影响。向种瘤后第7天的小鼠腹腔注射Ly6C单克隆抗体（隔天一次,共5次）清除包括moLCs在内的单核及单核来源的细胞后,观察其对黑色素瘤生长及免疫微环境的影响。结果:（1）利用muLangerin-DTR-EGFP小鼠模型清除rLCs后,黑色素瘤的生长加速。rLCs清除组黑色素瘤中分泌IFN-γ的CD8+T细胞减少,肿瘤引流淋巴结中Tregs的比例增加。（2）利用抗CSF1R单克隆抗体清除rLCs后,黑色素瘤的生长加速。黑色素瘤中IFN-γ+CD4+T细胞的比例减少。（3）利用Ly6C单克隆抗体清除包括moLCs在内的单核及单核来源的细胞后,黑色素瘤的生长延缓,但肿瘤Tregs、IFN-γ+CD4+T细胞、CD8+T细胞及IFN-γ+CD8+T细胞的比例无明显变化。结论:rLCs能通过促进抗肿瘤免疫应答从而抑制黑色素瘤生长。moLCs在内的单核及单核来源的细胞能促进肿瘤生长。第三部分人CD34阳性造血干细胞来源和单核来源的朗格汉斯细胞的表型及其诱导的耐受性适应性免疫反应不同目的:黑色素瘤可通过分泌多种抑制因子损伤DCs的激活和抗原提呈从而诱导DCs耐受。而TGF-β是肿瘤微环境中的最重要的免疫抑制因子之一。TGF-β也是维持LCs稳态及耐受状态的关键细胞因子。因此,TGF-β也可能成为黑色素瘤诱导LCs免疫耐受的重要细胞因子。CD34阳性造血干细胞和单核细胞能在细胞因子的刺激下分别被诱导为CD34-LCs和moLCs。CD34-LCs的转录组和人表皮LCs相似。CD34-LCs表现出较强的刺激同种异体T细胞的增殖和活化的能力。moLCs也能刺激T细胞增殖,但其细胞因子分泌水平较低。我们在该部分进一步研究了 TGF-β1诱导的耐受性CD34-LCs和moLCs的表型及刺激同种异体T细胞的功能。方法:将人脐带血CD34+干细胞经细胞因子FLT3L,TPO,SCF,GM-CSF,TGF-β1和TNF-α诱导成CD34-LCs。将人外周血单核细胞经细胞因子GM-CSF、TGF-β1、IL-4、TNF-α和Dex诱导成moLCs。经0、5或20 ng/mL的TGF-β1诱导耐受后（视目的继续用炎症因子混合物共培养）,流式检测CD34-LCs和moLCs表面CD80、CD86、HLA-DR及PD-L1的变化;RNA测序检测CD34-LCs和moLCs转录组的变化;流式检测CD34-LCs和moLCs刺激幼稚性CD4+T细胞、记忆性CD4+T细胞和记忆性CD8+T细胞增殖、分化或活化的能力。结果:（1）基础状态下,与CD34-LCs相比,moLCs表达更低的共刺激分子CD80、CD86和HLA-DR,表达更高的PD-L1。随TGF-β1浓度的增加,CD34-LCs表面CD80和HLA-DR逐渐减少,而moLCs表面PD-L1的表达逐渐增加。（2）CD34-LCs和moLCs的RNA测序的结果表明,moLCs和CD34-LCs的基因表达谱存在较大差异。moLCs表达更多单核和中性粒细胞的趋化因子、粘附/基质相关蛋白、TGF-β1等。CD34-LCs表达更多的rLCs特征性的分子Epcam和E-cadherin、迁移分子CXCR4和CCR7等。（3）体外对CD34-LCs和moLCs与不同种类的T细胞的共培养实验表明,TGF-β1诱导的耐受性moLCs诱导记忆性CD4+T细胞分化为Tregs的能力与CD34-LCs相当,但仅moLCs的能力可呈TGF-β1浓度和moLCs数目依赖性。TGF-β1诱导的耐受性moLCs诱导幼稚CD4+T细胞分化为Tregs的能力要强于CD34-LCs,且呈TGF-β1浓度和moLCs数目依赖性。TGF-β1诱导的耐受性moLCs诱导记忆性CD8+T细胞增殖及活化分泌TNF-α的能力总体弱于CD34-LCs。结论:moLCs 比 CD34-LCs表达更低的共刺激分子和更高的PD-L1,且更容易被诱导免疫耐受。耐受性moLCs更容易诱导记忆性和幼稚性CD4+T细胞分化产生更多Tregs并降低记忆性CD8+T细胞的增殖和活化,从而可能加速黑色素瘤免疫微环境的形成。