血管破损后发生的血小板凝血与白细胞炎症反应过程,涉及到血小板的黏附、活化、聚集及其与白细胞相互作用等血流动力学环境中发生的关键事件。循环的血小板通过黏附分子的介导与白细胞发生相互作用,协同介导冠脉斑块的早期形成和发展以及斑块破裂后的血栓形成。血小板分泌的CD40L和P-选择素是介导血小板与白细胞相互作用的关键分子,但其中的胞内力化学信号转导过程尚未清晰。首先,我们利用平行平板流动腔技术,在不同剪切力(0.1~0.5 dyn/cm2)条件下,观测和分析了白细胞在活化血小板上的黏附和滚动。实验中,将血小板黏附在包被v WF-A1分子的流动腔底板上,通过加载10 dyn/cm2流体剪应力激活血小板不同的时间(0 min、2.5 min和7.5 min)。随后,白细胞悬浮液以不同流速流过流动腔。利用高速摄像仪,观察和记录白细胞在活化的血小板上的黏附事件数、拴缚生存时间及滚动速度。结果表明:白细胞在流经活化血小板时,随着剪切力的增加,白细胞滚动速度呈现先减少后增加的趋势;而白细胞在血小板上的拴缚生存时间呈现先延长后缩短的趋势。这一双相力依赖的白细胞在活化血小板上的滚动黏附特性,不仅涉及到血小板关键分子(P-选择素和CD40L)的分泌,而且与复合物(PSGL-1/P-选择素、CD40L/CD40)的逆锁键机制相关。同时,血流剪应力刺激血小板激活时间的增加,将缩短白细胞在血小板上的滚动速度,提示力学刺激的强度或时间将调节血小板上关键分子(P-选择素和CD40L)的分泌。然后,我们运用原子力显微镜技术,在单分子水平,测量CD40L与受体CD40(单体和二聚体)、αMβ2的黏附频率,提取并分析黏附复合物(CD40L/CD40、CD40L/αMβ2)在不同拉力水平下分子键生存时间和解离常数。双相力依赖的CD40L-CD40、CD40L-αMβ2分子键解离常数提示,在受力阈值之下,CD40L/CD40、CD40L/αMβ2受-配体间的结合亲和力随力的增大而增强,而当力超过力学阈值之后,CD40L/CD40、CD40L/αMβ2受-配体间的结合亲和力随力的增大而减弱。CD40的二聚将显著增强CD40L-CD40分子键的生存时间,提高其能承受的最大断裂力。CD40聚化和血流剪应力共同诱导的CD40L-CD40亲和力的增强,CD40在脂筏上发生的聚化过程可能是两个细胞间形成稳定的胞间通讯所必需的。这些发现可能有助于在分子和细胞水平上理解CD40L-CD40(或αMβ2)诱导的重要生理或病理过程,揭示CD40L与其受体(CD40和αMβ2)相互作用的力学调控机制,旨在更深入理解心脑血管疾病的生理病理过程。最后,我们使用分子动力学(MD)模拟和基于统计的分子间氢键分析方法,研究了力学环境中PSGL-1胞质区与根蛋白FERM域的相互作用。MD模拟可从原子水平提供分子间运动的细节,通过时间函数来理解PSGL-1/ERM复合物的动态行为。通过分析氢键的平均数目和解离概率表明,“逆锁-滑移”键和力共同调控PSGL-1和ERM蛋白相互作用的结合亲和力。构象分析和残基溶剂可及表面积的变化都表明,经由PSGL-1传导的50pN的力可以介导根蛋白ITAM-like序列上磷酸化位点Y205的暴露。我们的结果证明了一条经由PSGL-1胞内域激活Syk的力学信号通路,并且在原子层面上对PSGL-1/ERM/Syk之间的相互作用给予了阐释。本文,针对白细胞与血小板相互作用这一前沿科学问题,综合运用生物化学与分子生物学、细胞分子生物力学等的理论原理、实验技术和分析方法,结合原子力显微镜、平行平板流动腔与分子动力学模拟等技术手段,开展系统深入的研究。力图阐明力如何调节白细胞在活化血小板上的滚动黏附,揭示血小板跨膜蛋白CD40L与其受体(CD40、αMβ2)相互作用的力学调控机制,探明白细胞上的PSGL-1与ERM蛋白相互作用的力-化学协同调控机制。旨在更深入理解心脑血管疾病的生理病理过程,为心脑血管疾病患者的临床治疗和康复,相关分子药物靶点的发现和抗体药物的新设计提供解决方案。