论文部分内容阅读
目的：探讨表面活性蛋白-B（surfactant protein B, SP-B）基因多态性和单体型与汉族患儿支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia, BPD）之间的相关性。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术和基因测序方法，对2008年1月至2012年6月在华中科技大学同济医学院附属同济医院新生儿重症监护病房收治的86例BPD组与156例对照组患儿SP-B基因4个多态性位点rs2077079，rs1130866，rs7316及内含子5基因型与等位基因分布情况进行检测，同时应用fastPHASE软件构建基因单体型。结果：内含子5缺失型基因型与野生型基因型在BPD组与对照组之间频率分布均有统计学差异（p=0.049与p=0.03）；缺失型等位基因（del）在对照组与BPD组频率分别为4.8%与10.5%，两组间频率分布具有统计学差异（p=0.018, OR=2.314,95%CI1.135-4.209）。rs2077079多态性在BPD组与对照组的频率分布差异有统计学意义（p<0.05）；C等位基因在BPD组与对照组的频率分别为45.3%和59.6%，差异有统计学意义（p=0.003, OR=0.56295%CI0.386-0.819）。rs1130866，rs7316基因型及等位基因频率分布在BPD组与对照组差异均无统计学意义（p>0.05）。单体型结果，C-inv-C-A单体型与C-inv-T-A单体型的频率分布在对照组均高于BPD组，且有显著性差异（p<0.05），而A-del-C-A单体型在BPD组的频率明显高于对照组（p=0.003）。结论：SP-B基因内含子5和rs2077079多态性与汉族患儿BPD相关，内含子5等位基因del为BPD危险因子，rs2077079C等位基因为BPD保护因子；SP-B基因rs1130866和rs7316多态性与汉族患儿BPD无相关性；单体型A-del-C-A与BPD相关，四种多态性位点之间可能存在部分连锁不平衡。目的：构建SP-B内含子5多态性野生型及缺失型两种真核表达质粒pIRSE2-EGFP-SP-B-intron5-inv与pIRSE2-EGFP-SP-B-intron5-del。方法：采用PCR方法扩增含有内含子5多态性的基因组DNA为目的基因，与pIRSE2-EGFP载体同时用Xho I和Hind III限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用T4DNA连接酶连接并转化大肠杆菌，卡那霉素筛选阳性菌落，采用PCR、酶切和测序方法对构建的质粒进行鉴定。结果：两种真核表达质粒pIRSE2-EGFP-SP-B-intron5-inv与pIRSE2-EGFP-SP-B-intron5-del含有SP-B内含子5基因对应的目的片段。结论：成功构建了重组质粒pIRSE2-EGFP-SP-B-intron5-inv与pIRSE2-EGFP-SP-B-intron5-del。目的：检测两种重组质粒pIRES2-EGFP-SP-B-intron5转染293T细胞与H441细胞后SP-B mRNA与蛋白的表达情况，探讨SP-B内含子5多态性影响SP-B基因表达的机制。方法：采用脂质体法将两种重组质粒pIRES2-EGFP-SP-B-intron5导入293T细胞与H441细胞中，荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白在293T细胞中表达，采用有限稀释法挑选转染的H441细胞单克隆；RT-PCR（reverse transcription-PCR）及western印迹检测SP-B mRNA剪接情况以及SP-B蛋白表达。结果：重组质粒瞬时转染293T细胞，转染效率在50%以上；引物对zx与fx1的PCR产物中，质粒pIRES2-EGFP-SP-B-intron5-inv转染的293T细胞条带约300bp，pIRES2-EGFP-SP-B-intron5-del转染的293T细胞有两条带，分别为300bp与950bp左右；引物对zx与fx2的PCR产物在两种质粒转染的293T细胞中目的条带片段长度一致约320bp；引物对zx与fx3的PCR产物在野生型重组质粒转染的293T细胞中PCR产物长度约为730bp，而缺失型转染的细胞中约为530bp。 SP-B中间抗体DTB检测两种转染的293T细胞SP-B蛋白表达，见一条大约30kDa的条带，野生型重组质粒转染的细胞中蛋白表达明显高于缺失型（p<0.05）；两种质粒转染的H441细胞中蛋白条带与未转染的H441细胞条带一致，42kDa大小SP-B前体蛋白及25kDa大小SP-B蛋白中间体，但缺失型重组质粒转染的细胞中蛋白表达明显低于野生型转染的细胞（p<0.05）。结论：本研究中SP-B内含子5缺失型变异引起SP-B RNA剪接异常，产生不完全剪接的mRNA，同时也存在正常剪接的mRNA，其多态性影响正常SP-B mRNA及SP-B蛋白表达，这种机制可能与缺失型等位基因del增加BPD发病风险相关。