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目的:明确筛选的关键性circRNA在β-AP生成中的作用;证实PNS可通过调节circRNA的表达,从而影响β-AP产生。为以circRNA为靶点研发防治AD新药提供理论和实验依据。方法:1.关键性circRNA的筛选及验证:利用表达谱芯片技术筛选AD模型小鼠SAMP8脑内海马组织中差异表达的circRNA;通过生物信息学预测与β-AP产生有关的关键性circRNA;采用RT-q PCR在扩大样本中验证筛选的关键性circRNA。2.mmu-circ-000692的功能验证及其调控β-AP生成的机制:利用RNA酶消化法和核苷酸测序法检测mmu-circ-000692的PCR产物。构建慢病毒过表达颗粒感染小鼠海马神经元HT-22细胞及小鼠脑神经瘤细胞N2a细胞模型,酶联免疫法检测空白质粒组和过表达组中Aβ1-42的表达情况,RT-q PCR检测β-AP对mmu-circ-000692表达的影响。采用mi RNA向量回归法(mir SVR)分析与mmu-circ-000692结合的靶mi RNAs,通过Mirwalk和Targetscan在线网站预测上述靶mi RNA的m RNA。RT-q PCR和western blot检测mmu-circ-000692对胰岛素降解酶IDE表达的影响。RT-q PCR检测mmu-circ-000692对mi R-298-5p和mi R-346-3p表达的影响。3.PNS对关键性circRNA的表达调控:3月龄SAMP8 AD模型小鼠随机分为模型组、PNS高剂量组(200mg/Kg)、PNS低剂量组(100mg/Kg),PNS灌胃给药,模型组给予相同体积的双蒸水,每天一次,连续2个月。应用Morris水迷宫检测各组小鼠学习记忆能力的变化;RT-q PCR检测芯片中差异表达的关键性circRNA表达;运用生物信息学手段预测circRNA启动子区可能结合的转录因子,Western blot检测小鼠脑组织转录因子蛋白表达。结果:1.基因芯片筛选结果显示在10月龄AD模型小鼠SAMP8与SAMR1相比有差异表达的circRNA共有85个,其中上调45个,下调40个。芯片筛选后,采用生物信息学方法预测差异表达的circRNA结合的的mi RNA。结果发现,在85个差异表达的circRNA中,总共有352个mi RNA可能与circRNA存在直接相互作用。接着采用mi RNA靶基因在线软件(mi Rwalk)预测能与这些基因结合的mi RNA。最终确定与上述基因结合的关键性mi RNA共有34个。根据这些关键性mi RNA,确定β-AP产生有关的关键性circRNA。根据上述方法,我们筛选到了30个与β-AP产生有关的关键性circRNA。随后,我们挑选出差异表达最大4个的关键性circRNA,并检测了这些circRNA在SAMP8小鼠海马中的表达。结果显示,与同月龄的SAMR1(与SAMP8同一来源的正常鼠)相比,3月龄SAMP8小鼠海马mmu-circ-000692、mmu-circ-017963的表达显著降低,mmu-circ-013636、mmu-circ-013699的表达显著升高;6月龄SAMP8小鼠海马mmu-circ-000692、mmu-circ-017963、mmu-circ-013636、mmu-circ-013699与3月龄相比显著降低,这提示在AD发展过程中circRNA可能参与调控β-AP形成。2.根据上述结果,我们选择了mmu-circ-000692进行进一步研究。RNA酶消化实验结果显示,RNA酶消化组mmu-circ-000692含量与未消化组相比没有显著性差异,而β-actin在RNA酶消化组的表达与未消化组相比显著降低。这表明上述扩增产物中的circRNA耐RNA酶消化。mmu-circ-000692产物测序结果表明产物的核苷酸序列与circbase中mmu-circ-000692序列完全重合。表明引物扩增的产物为mmu-circ-000692。为了探讨mmu-circ-000692在β-AP生成中作用,我们将mmu-circ-000692的过表达慢病毒颗粒转染给N2a和HT22细胞,Elisa试剂盒检测细胞内β-AP的含量。结果发现,与相应的对照组相比,过表达mmu-circ-000692可显著减少N2a和HT22细胞β-AP的含量。这提示mmu-circ-000692可显著抑制β-AP生成。为了明确β-AP对mmu-circ-000692表达的影响,我们将20μM Aβ25-35加入HT22细胞作用24h,RT-q PCR检测细胞mmu-circ-000692的表达。结果表明,与对照组相比,β-AP可显著抑制细胞mmu-circ-000692的表达。mi RNA向量回归法(mir SVR)分析与mmu-circ-000692结合的靶mi RNA,5个得分最高的mi RNA分别为mi R-6940-5p、mi R-3074-5p、mi R-298-5p、mi R-7001-5p和mi R-346-3p,在线网站预测这5个靶mi RNA的m RNA,取交集后发现,在这5个mi RNA中,mi R-298-5p和mi R-346-3p均存在IDE结合位点,且预测得分较高。提示IDE可能是mi R-298-5p和mi R-346-3p靶m RNA。随后,在过表达mmu-circ-000692的N2a和HT22细胞上检测了IDE基因和蛋白的表达。结果显示,与相应的对照组相比,过表达mmu-circ-000692组细胞IDE基因和蛋白表达均显著升高。过表达mmu-circ-000692后N2a和HT22细胞mi R-298-5p和mi R-346-3p的表达与相应的对照组相比没有显著变化。这提示,mmu-circ-000692可能通过mi RNA“海绵”作用吸附mi R-298-5p和/或mi R-346-3p而发挥作用。但mmu-circ-000692与mi R-298-5p和mi R-346-3p的结合作用还需要进一步研究。3.为了探讨PNS是否改善AD学习记忆能力,我们采用水迷宫检测了PNS干预后SAMP8小鼠学习记忆能力。结果显示,与模型组比较,PNS高、低剂量组的平均逃避潜伏期明显缩短,平台象限停留时间百分比显著升高;原平台象限穿越次数明显增多,提示PNS可显著改善AD学习记忆损害。前期研究发现,PNS可显著抑制AD小鼠β-AP产生,为了探讨PNS是否通过调控关键性circRNA而抑制β-AP形成,我们采用circRNA芯片检测了PNS干预与不干预小鼠有差异表达的circRNA。结果显示,PNS干预与不干预小鼠有差异表达的circRNA有9个,其中上调3个,下调6个。我们随后在扩大样本中检测了这些关键性circRNA表达,结果表明,与模型组相比,高剂量组的mmu-circ-001456、mmu-circ-000692、mmu-circ-017963、mmu-circ-013636、mmu-circ-003540、mmu-circ-006173、mmu-circ-006229、mmu-circ-013699、mmu-circ-012180基因表达水平升高,低剂量组的mmu-circ-013636表达水平升高。这提示上述circRNA可能介导了PNS对β-AP形成的抑制作用;为了探讨PNS调控关键性circRNA的机制,我们首先通过生物信息学的方法预测了调控上述circRNA的转录因子,结果发现得分较高的5个转录因子为JUN、NFKB1、NFIC、SP1、STAT1;随后我们采用western blot法在扩大样本中验证了上述转录因子的表达,结果显示,与模型组比较,高剂量组和低剂量组小鼠脑组织SP1的蛋白表达水平降低,STAT1的蛋白表达升高,而JUN、NFKB1和NFIC的蛋白表达与模型组比较没有显著性差异。这提示PNS可能通过调控转录因子SP1和SATA1的活性来调控关键性circRNA表达。结论:1.mmu-circ-000692可能通过mi RNA“海绵”作用吸附mi R-298-5p和/或mi R-346-3p而发挥下调β-AP的作用。2.PNS可改善SAMP8小鼠的学习记忆能力,同时;通过调控转录因子SP1和STAT1的表达来调控circRNAs的表达,从而抑制β-AP形成。