陆地棉谷胱甘肽过氧化物酶家族序列和功能初步分析

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谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)是清除活性氧的一类主要酶。许多关于GPX的研究发现,GPX家族在植物应答和防御生物和非生物胁迫中都发挥着重要作用。本论文主要以陆地棉为研究对象,通过生物信息学分析、组织表达分析、亚细胞定位研究和GPX的活检测等手段,对陆地棉GPX家族的基因序列进行归纳、分析和初步的功能检测。  我们根据拟南芥GPX家族氨基酸序列,利用BLASTp分析工具,在中棉所数据库中发现陆地棉的12个GhGPX基因,分别命名GhGPX1-GhGPX12,它们分别位于A基因组和D基因组。生物信息学分析发现,GhGPX家族的12个基因的氨基酸序列,具有典型的GPX结构中的三个保守结构域和三个半胱氨酸位点;除了GhGPX5和GhGPX11的蛋白质分别为562个和245个氨基酸,其他GhGPX基因的氨基酸序列长度在156-171之间。分子量也都在18-19KD之间。对GhGPX蛋白质序列进行亚细胞定位预测分析,结果表明 GhGPX1可能位于叶绿体,GhGPX5可能位于线粒体或者是叶绿体,其余的10个GhGPX可能位于胞质。从水稻、杨树、拟南芥和陆地棉的进化树比较分析中发现,陆地棉中的GPX与其余的几个物种GPX间同源性较低。  定量PCR分析发现,GhGPX1、GhGPX4、GhGPX6、GhGPX7、GhGPX8和GhGPX12在棉花的根、茎、真叶和子叶中都有表达,其中GhGPX1在真叶中表达量最高。对不同的非生物胁迫下棉花幼苗的GPX基因表达分析发现,35℃高温能诱导叶片中的GhGPX7表达,35℃高温处理陆地棉24 h时后,根中 GhGPX1、GhGPX6、GhGPX7、GhGPX8和GhGPX12表达量都有明显的提升;根中的GhGPX6和叶中的GhGPX12受NaCl诱导表达,其表达量约为原来的三倍;当用FeSO4处理时,叶片中的GhGPX1、GhGPX6、GhGPX7、GhGPX8和GhGPX12都呈现表达量先上调后下降的表达模式;当用ABA处理时,叶中GhGPX12的表达量上调四倍左右;当用MeJA涂抹棉花的幼叶3 h后,GhGPX4基因的表达量上调了二十倍左右;在用SA涂抹棉花的叶片时,GhGPX1和GhGPX4的表达量均有所上调。利用拟南芥叶肉细胞原生质体转化系统表达GhGPX蛋白,通过激光共聚焦显微镜观察发现, GhGPX1-GFP融合蛋白定位于叶绿体, GhGPX2-GFP,GhGPX4-GFP,GhGPX6-GFP,GhGPX7-GFP和 GhGPX9-GFP定位于细胞质。利用酵母 GPX3功能缺失突变体,将 GhGPX基因转到 GPX3酵母突变体中,分析发现转入GhGPX2、GhGPX4、GhGPX6和 GhGPX7能增强酵母 GPX3突变体抗氧化性,表明GhGPX2、GhGPX4、GhGPX6和GhGPX7具有清除活性氧的功能。  综上所述,本研究鉴定了陆地棉中的GPX家族的12个基因,这些基因在棉花的不同组织中表达量不同,可能定位于细胞质和叶绿体中;GhGPX广泛应答于各种非生物胁迫,具有清除活性氧的功能,可能在棉花的抗逆环境生长发育中起着重要作用。本研究后续实验已经原核表达GhGPX2、GhGPX6和GhGPX7的蛋白,为进一步对GhGPX的蛋白活性的研究提供实验材料。
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