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目的：1．构建人CD44基因变异体(CD44variant，CD44v)真核表达载体(pcDNA3.1—CD44v)，并将其稳定转染入人乳腺癌细胞株(MCF-7)中，为深入研究CD44v基因的功能奠定基础。2．将人乳腺癌多药耐药细胞株(MCF-7/Adr)中新发现的CD44v(GeneBankNo．FJ216964)转染入MCF-7细胞株中，观察MMP-2、MMP-9表达水平的变化，分析CD44v与MMP-2、MMP-9表达的关系，研究CD44v对MCF-7细胞株侵袭能力的影响，探讨CD44v调节MMP-2、MMP-9表达的胞内信号转导机制。3．观察转染pcDNA3.1—CD44v前后，MCF-7细胞株增殖方面的差异。
方法：1．采用RT—PCR及流式细胞术，鉴定MCF-7及MCF-7/Adr细胞株中CD44基因及蛋白的表达。2．从MCF-7/Adr细胞中提取总RNA进行RT—PCR，获得全长cDNA模板，使用含有限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点引物进行PCR反应，从而获得带有酶切位点CD44基因产物，PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，并参照胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收，纯化。3．将PCR纯化产物连接于pMD19—Tsimplevector上，TA克隆后，提取质粒并测定含量及进行双酶切反应验证，将含阳性质粒转化菌进行DNA测序。4．KpnⅠ和EcoRⅠ分别双酶切真核表达载体pcDNA3.1和CD44TA克隆质粒，T4连接酶定向连接，大肠杆菌扩增，小提质粒后酶切鉴定，阳性质粒进行测序验证。5．脂质体法将pcDNA3.1—CD44v质粒转染到MCF-7细胞中，48小时后RT—PCR和流式细胞术检测转染前后CD44基因、蛋白在MCF-7细胞中的表达变化。6．透明质酸(hyaluronan，HA)处理细胞24小时后，收集各实验组细胞进行RT—PCR检测，检测各组细胞CD44v，MMP-2及MMP-9mRNA表达情况，并收集细胞培养上清，离心后进行明胶酶谱法分析MMP-2、MMP-9蛋白活性，从而了解CD44v对MMP-2、MMP-9表达水平的影响。7．Transwell检测各实验组细胞侵袭力变化情况。8．westernblotting检测erk及磷酸化erk(p—erk)变化，从而探讨CD44v调节MMP-2及MMP-9表达的胞内信号转导机制。9．显微计数法及流式细胞术检测CD44v对MCF-7/CD44v细胞增殖能力的影响。
结果：1．CD44基因在多药耐药MCF-7/Adr细胞中高表达，而在亲代敏感细胞株MCF-7中不表达。2．将该CD44基因克隆入pMD19—T载体中，经TA克隆后进行测序验证，结果显示：该CD44v包含CD44基因1-4号外显子、16-17号外显子、18号外显子1-205位硷基；将该基因序列登录NCBI，基因登录号FJ216964。3．将CD44v成功克隆入pcDNA3.1质粒中，产生重组质粒pcDNA3.1—CD44v，并通过酶切及DNA测序验证。4．转染重组质粒pcDNA3.1—CD44v48小时后，通过RT—PCR方法，在MCF-7中检测到CD44基因mRNA表达明显上调，流式细胞术检测发现CD44蛋白表达水平上调，表达率为(70.0±2.5)％；将上述表达CD44基因及蛋白的瞬时转染MCF-7细胞经G418筛选后获得阳性克隆。5．转染重组质粒载体pcDNA3.1—CD44v并用透明质酸处理作用24小时后，MCF-7细胞株中MMP-2、MMP-9mRNA表达明显上调，相应蛋白活性与mRNA水平呈现一致性改变，细胞侵袭力明显上调(P＜0.05)；透明质酸(HA)→CD44通过ras信号依赖性的方式调节MMP-2、MMP-9表达及转染细胞(MCF-7/CD44v)侵袭力。6．中和性CD44单抗预处理MCF-7/CD44v细胞后，显著阻断了MMP-2，MMP-9分泌及MCF-7/CD44v细胞侵袭力。7．CD44v可以使MCF-7/CD44v细胞增殖能力下降。
结论：1．在MCF-7/Adr中新发现一种CD44v(GeneBankNO．FJ216964)，成功克隆和建立人CD44v真核表达质粒载体(pcDNA3.1—CD44v)，将该质粒载体导入MCF-7细胞后，CD44v表达明显上调，这为进一步研究其功能打下了基础。2．在MCF-7细胞中，CD44v可以通过上调MMP-2、MMP-9表达水平，从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。3．透明质酸可能与CD44受体相结合，通过CD44→ras→MAPK信号传导通路调节MMP-2、MMP-9产生，从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。4．中和性CD44单抗预处理MCF-7/CD44v细胞后，可以显著阻断MMP-2、MMP-9分泌，降低MCF-7/CD44v细胞侵袭力。5．CD44v过表达可以抑制MCF-7/CD44v细胞增殖能力。