【摘 要】
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研究背景骨髓间充质干细胞来源的外泌体（Bone mesenchymal stem cells-derived exosomes,B-exo）在促进骨修复和调节免疫应答方面都发挥着重要功能。外泌体作为骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）发挥功能的一种新途径,能够作用于多种免疫细胞从而调节免疫功能。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81672180）； 深圳市三名工程项目（SZSM201612019）； 深圳市数字外科3D打印重点实验室（ZDSYS201707311542415）；
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研究背景骨髓间充质干细胞来源的外泌体（Bone mesenchymal stem cells-derived exosomes,B-exo）在促进骨修复和调节免疫应答方面都发挥着重要功能。外泌体作为骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）发挥功能的一种新途径,能够作用于多种免疫细胞从而调节免疫功能。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为最重要的抗原提呈细胞,能否受到B-exo的影响从而促进免疫耐受。这可能在移植免疫相关的研究领域拥有广泛的应用前景。研究目的本项研究旨在探讨B-exo是否能够通过调节树突状细胞的致耐受功能从而促进移植免疫耐受。材料与方法从小鼠骨髓细胞中分离培养BMSCs和DCs并进行鉴定。分离纯化BMSCs培养上清中的外泌体,利用透射电镜、粒径分析和特异性蛋白检测对外泌体进行定性分析。将BMSCs和DCs混合培养48h后,收集上层DCs对其表面标志物以及炎症相关细胞因子的mRNAs表达水平进行检测。然后将分离纯化的B-exo与DCs进行共培养,收集DCs检测吲哚胺2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）的mRNA和蛋白表达水平。将处理后的DCs与小鼠脾脏的na（?）ve CD4+T细胞共培养,分析CD4+T细胞增殖情况和CD4+CD25+Foxp3+T细胞占比。最后,我们将BALB/c小鼠皮肤移植至C57小鼠背部,建立小鼠异体皮肤移植模型;同时将不同处理组的DCs通过尾静脉回输受体体内。观察皮肤移植物存活时间,在术后12天进行组织学检测并对受体脾脏中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的占比情况进行分析。结果我们能够成功地对BMSCs进行成骨、成脂和成软骨分化,同时BMSCs表达与细胞干性相关的表面标志物。在诱导培养过程中DCs形成典型的细胞集落,在用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激成熟后,未成熟 DCs（immature DCs,imDCs）表面的CD80、CD86和主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complex class Ⅱ,MHC-Ⅱ）分子的表达量显著低于成熟 DCs（mature DCs,mDCs）。透射电镜显示B-exo呈杯状的双层膜结构;粒径分析提示外泌体直径分布只有一个峰值:89 nm。Western Blot显示外泌体表达特异性标志蛋白。在与BMSCs共培养后,DCs的表面分子（CD80、CD86和MHC-Ⅱ）以及促炎细胞因子（IL-6和IL-27）的mRNAs表达量降低,而抑炎细胞因子（TGF-β、IL12、IL-10）的mRNAs表达量升高。上述BMSCs对DCs的作用在加入GW4869（外泌体抑制剂）后被部分抑制。DCs中IDO的蛋白和mRNAs表达水平在一定范围内随着BMSCs-exo浓度的增加而增加。B-exo处理过的DCs可抑制CD4+T细胞的增殖并诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞的分化。上述B-exo对DCs的作用在加入1-甲基-色氨酸（1-methyl tryptophan,1MT）（IDO抑制剂）后被部分抑制。最后,在小鼠皮肤移植模型中,B-exo共培养过的DCs能够延长皮肤移植物的存活时间、保持较完整的皮肤组织结构,并且在受体小鼠脾脏中提高CD4+CD25+Foxp3+T 细胞的占比。结论综上所述,B-exo能够抑制DCs的成熟过程,并通过提高IDO的表达量强化DCs的免疫调节功能,从而促进异体皮肤移植的免疫耐受。
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