人凝血酶及纤维蛋白原的制备

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本文叙述了人纤维蛋白原和凝血酶的性质、用途。综述了国内外对纤维蛋白原和凝血酶的研究现状和制备技术。探讨了纤维蛋白原和凝血酶的作用机理,及影响含量或活性因素。通过大量实验研究了以cohn组分Ⅰ为原料,采用低温乙醇法制备纤维蛋白原及以cohn组分Ⅲ为原料,通过离子交换层析法制备凝血酶的最佳工艺条件。利用S/D处理灭活脂包膜病毒。 实验过程中,先用单因素实验,寻求各影响因素的合适范围,在分别进行多因素正交实验,以寻求制备人纤维蛋白原和凝血酶的最佳工艺条件。实验中,分别得到以下优惠条件: (1) 纤维蛋白原:采用pH6.8的tris/枸橼酸盐/赖氨酸缓冲液溶解富集纤维蛋白原的cohn组分Ⅰ沉淀糊,溶液经1μm微孔膜浓缩至蛋白浓度为10-20g/1,浓缩液以0.3%TNBP和1%Tween 80在25℃处理8小时。4℃经10%乙醇沉淀两次。沉淀在30℃用pH7.0的tris/NaCl缓冲液溶解。 (2) 凝血酶:采用pH7.5的Tris-HC1缓冲液溶解富集PCC的cohn组分Ⅲ,加入3%的PEG6000沉淀.溶液用大豆磷脂激活,经S/D灭活病毒。凝血酶经CM离子交换液相层析柱进一步纯化。凝胶经0.06mol/1 tris-HC1,pH7.5平衡,凝血酶被pH7.5的0.06mol/1 tris-HC1、1%NaCl缓冲液洗脱,流速3.8ml/min。 经蛋白测定,纤维蛋白原的可凝固蛋白含量大于90%,凝血酶的比活大于70U/mg。 本研究的创造性在于:采用大豆磷脂激活由cohn组分Ⅲ沉淀制备的凝血酶原。凝血酶采用CM biosep FF(国产),经一次离子交换液相层析纯化。此工艺国内未见报道,属国内首创。 本研究的意义是:目前,国内大多数血液制品企业将cohn组分Ⅰ和组分Ⅲ沉淀废弃。纤维蛋白原和凝血酶现在广泛应用于外科领域。此工艺将提高企业经济效益,适合我国国情。
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