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microRNAs (miRNAs)是一类长约22nt的非编码RNA，它在转录后水平调控靶基因的表达而参与组织器官发育、细胞的分裂与增殖、凋亡、肿瘤及其他疾病的调控。研究表明，miRNAs参与胰岛发育、β细胞增殖、胰岛素的产生与分泌，从而调控糖尿病的发展过程，但目前miRNAs对胰岛素产生和分泌的调控机制尚不清楚。研究miRNAs靶基因参与的信号通路，探索miRNAs对靶基因及相关疾病的调控机制，已成为现代生物学研究的热点。本论文以小鼠胰岛瘤细胞MIN6和糖尿病小鼠模型db/db小鼠为研究对象，研究miR-30d在体内外对靶基因的调控和诱导胰岛素信号传导、胰岛素产生和分泌的机制。研究结果如下。1.原位杂交和real-time PCR检测miR-30d在db/db小鼠胰岛中的表达，结果表明，miR-30d在糖尿病小鼠中表达量降低，而与细胞凋亡有关的let-7显著升高。双荧光素酶试验结果显示，过表达miR-30d能够显著增加RIP启动的荧光素酶活性。以上结果说明，miR-30d通过促进胰岛素基因转录调控糖尿病的发生和发展。2. Western blot和real-time PCR检测在MIN6中过表达miR-30d对MafA的作用，结果表明，高糖促进MafA表达，过表达miR-30d能够促进MafA的转录和表达。免疫荧光试验表明，过表达miR-30d显著激活MafA在MIN6细胞中的表达。Real-time PCR检测小鼠胰岛中过表达miR-30d对MafA和胰岛素的作用，结果显示过表达miR-30d可显著促进MafA和胰岛素基因转录。Western blot结果显示miR-30d可促进MafA的表达。3. Western blot检测miR-30d和TNF-α对MafA、Pdx-1和IRS2作用，结果显示TNF-α可显著抑制MafA、Pdx-1、IRS2的表达，而过表达miR-30d可降低TNF-α对MafA和IRS2的抑制作用，抑制miR-30d则使TNF-α进一步抑制MafA和IRS2表达，但对Pdx-1没有作用。将同样处理的细胞进行胰岛素分泌试验，结果表明，TNF-α可显著抑制胰岛素的分泌，过表达miR-30d可部分恢复胰岛素分泌水平。4. Western blot检测miR-30d对Map4k4的影响。结果表明，过表达miR-30d可抑制Map4k4的转录和表达。双荧光素酶试验结果表明，过表达miR-30d导致Map4k4-WT荧光素活性降低，而Map4k4-miR30d结合位点发生点突变的Map4k4-mut的荧光素酶活性没有降低。这说明miR-30d可与Map4k43′UTR结合而抑制转录和表达，从而Map4k4是miR-30d的直接靶基因。原位杂交检测db/db小鼠胰岛中Map4k4和miR-30d的表达，结果表明糖尿病小鼠胰岛中Map4k4染色显著增加，miR-30d染色显著减弱。Real-timePCR和western blot检测Map4k4在小鼠胰岛中的表达水平，结果表明，在db/db小鼠胰岛中Map4k4转录和表达均增加。5. Western blot和real-time PCR检测Map4k4的表达，结果表明，TNF-α处理的MIN6细胞中Map4k4的蛋白水平和mRNA水平均增加，说明TNF-α可诱导Map4k4转录和表达。Real-time PCR、western blot检测沉默Map4k4对胰岛素、MafA、Pdx-1及IRS2作用，结果沉默Map4k4能够显著恢复胰岛素、MafA和IRS2的表达，但对Pdx-1没有影响。本研究发现miR-30d通过与靶基因Map4k4的作用而上调胰岛素转录因子MafA，从而促进胰岛素的表达和分泌，降低TNF-α诱导的胰岛素基因转录、产生及分泌抑制，揭示了miR-30d对糖尿病发生的调控机制，为糖尿病治疗提供新的思路。