【摘 要】
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目的:1.非侵入性方法研究慢性肾功能不全患者眼表功能障碍及其泪液分泌改变,并探讨角膜神经在其眼表改变中的作用。2.探讨慢性肾功能不全体外模型-高尿素干预下,神经多肽P物质对角膜上皮细胞Akt/GSK-3β抗凋亡信号通路的调控作用。方法:招募慢性肾功能不全患者及与其性别年龄相匹配正常受试者各30人;1.泪液学检查:采用Oculus Keratograph5M对所有受试者进行非侵入性眼表综合分析,其中
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目的:1.非侵入性方法研究慢性肾功能不全患者眼表功能障碍及其泪液分泌改变,并探讨角膜神经在其眼表改变中的作用。2.探讨慢性肾功能不全体外模型-高尿素干预下,神经多肽P物质对角膜上皮细胞Akt/GSK-3β抗凋亡信号通路的调控作用。方法:招募慢性肾功能不全患者及与其性别年龄相匹配正常受试者各30人;1.泪液学检查:采用Oculus Keratograph5M对所有受试者进行非侵入性眼表综合分析,其中包括非侵入性泪膜破裂时间、泪河高度、睑板腺红外拍照评分、结膜充血分级;采用LipiView对受试者进行泪液脂质层厚度分析;采用OSDI干眼问卷对受试者进行眼表症状评分;采用荧光素钠和丽丝胺绿眼表染色试纸对受试者进行角膜和结膜染色评分;取受试者泪液进行神经肽P物质浓度ELISA分析。2.角膜知觉及角膜神经检查:采用角膜知觉测试仪对受试者进行角膜知觉的测量;海德堡HRT3-CM共聚焦激光角膜显微镜对受试者进行角膜上皮下神经拍照,NeuronJ软件对照片上的角膜神经进行定量分析,分析内容包括:角膜上皮下神经密度、角膜神经数量、平均神经长度、最大及最小神经长度,并进行神经弯曲度、神经反光度分级。3.体外研究:培养人角膜上皮细胞,免疫组化进行细胞鉴定;对角膜上皮细胞进行慢性肾功能不全疾病体外造模,并分组干预:空白对照组、20mmol/L 高尿素组、20mmol/L 高尿素+1μmol/L SP 组、20mmol/L 高尿素+1μmol/L SP+1μmol/L Akt抑制剂组;CCK-8实验进行不同组角膜上皮细胞活性检测;AnnexinV-FITC凋亡实验进行不同组角膜上皮细胞凋亡检测;Western-blot 测量各组 P-Akt,P-GSK-3β,Caspase3 蛋白表达情况。结果:1.慢性肾功能不全患者泪液分泌功能中非侵入性泪膜破裂时间缩短,角膜染色和眼表染色评分增加,干眼症状OSDI评分增加,结膜充血指数增高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。2.共聚焦显微镜下发现慢性肾功能不全组角膜上皮神经数量及形态改变,表现为:上皮下神经密度下降,平均神经长度降低,神经束数量降低,神经弯曲度增加,且与角膜染色评分存在负相关（P<0.05）。3.角膜知觉测试中慢性肾功能不足患者角膜知觉略低,且泪液中神经分泌多肽P物质浓度下降,与对照组有显著差异（P<0.05）。4.体外细胞实验中,成功培养了人角膜上皮细胞,免疫组化法检测角膜细胞角蛋白AE5染色阳性;CCK-8细胞活性实验检测20mmol/L高尿素干预下人角膜上皮细胞活性下降,加入P物质可以增加角膜上皮细胞活性,而加入Akt抑制剂可拮抗P物质作用,差异有统计学意义（P<0.05）;AnnexinV-FITC细胞凋亡试验显示,高尿素组与正常组相比细胞凋亡比例升高（P<0.05）,P物质干预下可降低细胞凋亡比例（P<0.05）;Akti抑制剂可轻度拮抗P物质的作用;Western-blot检测发现高尿素+SP组抗凋亡蛋白P-Akt表达增加,P-GSK-3β表达增加,凋亡蛋白Caspase3表达量降低,Akti抑制剂可以抑制P物质对Akt/GSK-3β通路的效应。结论:非侵入性评估慢性肾功能不全患者眼表状态发现其存在泪液分泌功能下降和眼表损伤增加。角膜共聚焦显微镜发现慢性肾功能不全患者存在角膜神经形态和数量的改变,角膜知觉下降,泪液中神经肽P物质下降。离体实验表明神经分泌多肽P物质可通过增强Akt/GSK3-β信号通路抑制人角膜上皮细胞的凋亡。
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