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丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase）俗称谷丙转氨酶,它是糖异生和氨基酸代谢过程中一个至关重要的酶,主要分布在肝脏组织中。当肝组织损伤因为病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化及药物因素损伤时,肝细胞中的ALT释放入血,使血清中ALT显著增高。因此,在过去的50多年间,临床上一直把血清中ALT作为反映肝功能的一个重要的生物标志物。通过对血清中ALT的检测,可以反映出肝脏功能是否损伤以及损伤的程度。近年来发现人体中ALT有3种同功酶,ALT1、ALT2和ALT2-2。实验研究发现,ALT1与ALT2有着共同的催化活性,而ALT2-2未发现有催化活性。ALT1主要分布在肝脏、骨骼肌和肾脏组织中,亚细胞定位于胞浆和内质网;ALT2主要分布在心肌细胞和骨骼肌中,而在肝脏和肾脏组织中未见表达,亚细胞定位于线粒体和内质网,在胞浆中不存在。因此,血清中ALT1水平比总ALT能更特异的反应肝脏功能状态。目前,临床上对ALT的检测主要是通过检测总的ALT酶活性来完成的。这种方法虽然操作相对简便,结果准确,但要依赖常规的生化检测仪器,不能满足在献血现场对献血员ALT的快速筛查。我们拟建立基于免疫学诊断技术的检测方法,对血清中ALT1的实际含量进行快速检测,以满足献血现场对血源筛查的需要,并且可以更准确、特异地反应肝脏功能。为进一步研发ALT1免疫学体外诊断试剂奠定基础。本课题拟制备出ALT1特异的抗体。目的:原核表达截短的ALT1蛋白,用它免疫新西兰大白兔后,制备出特异的ALT1多克隆抗体;用合成的表位肽免疫BALB/c小鼠,制备特异的ALT1单克隆抗体。为研发ALT1免疫学体外诊断试剂奠定基础。方法:1.利用分子克隆技术构建ALT1截短表达载体pCold-TF-ALT1。2.将表达载体转化入BL21（DE3）表达宿主菌,经IPTG诱导及SDS-PAGE分析表达形式后,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白,再经HRV-3C蛋白酶酶切后,应用凝胶过滤法去除标签蛋白,进而得到不带标签的截短ALT1蛋白。3.通过B细胞抗原表位预测软件分析ALT1的抗原表位,综合分析后,选取两段肽MC-15和CK-17交予公司合成,并分别偶联KLH以增加免疫原性。4.用纯化的截短ALT1蛋白免疫新西兰大白兔,制备ALT1多克隆抗体。5.用人工合成偶联有KLH的MC-15、CK-17表位肽分别免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备ALT1单克隆抗体。结果:1.成功构建ALT1的截短表达质粒,通过PCR和双酶切鉴定得到与预期大小一致的基因片段,同时通过基因测序分析证实完全一致,并无移码突变。2.通过镍离子亲和层析纯化后得到较纯的重组截短表达蛋白,融合蛋白再通过HRV-3C蛋白酶酶切后经分子筛纯化得到不带标签的目的蛋白。3.用纯化的ALT1截短表达蛋白免疫新西兰大白兔后,制备出了特异性好、效价高的ALT1多克隆抗体。4.用人工合成偶联有KLH的MC-15、CK-17表位肽免疫BALB/c小鼠,建立了多株稳定分泌ALT1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过腹水诱生法制备了腹水型ALT1单克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验法证明了腹水效价可达106,并可识别人血清中的ALT1蛋白。结论:重组表达的截短融合蛋白经镍离子亲和层析纯化后,得到的融合蛋白再通过HRV-3C蛋白酶酶切后应用分子筛得到目的蛋白,用此蛋白制备了ALT1特异性的多克隆抗体;用合成的表位肽制备了特异性的单克隆抗体。为进一步研发ALT1免疫学体外诊断试剂奠定基础。