研究背景:周围神经损伤一直是修复重建外科难以攻克的一大难题。选择合适的材料制备再生导管和提供神经再生的细胞是周围神经修复研究领域中的重要内容。相比于非生物材料导管,生物材料具有排异反应小,吸收率高,无毒性等特点。腹外斜肌外膜是一层含有骨骼肌的致密结缔组织,其贴附于小鼠背部腹外斜肌外侧,取材方便且无供区功能损伤,拥有定向排列的基底膜和细胞外基质,易于种子细胞的粘附、迁移和增殖,且其中含有肌源性干细胞(Muscle derived stem cell,MDSC),不仅有向骨骼肌分化的潜能,也具有向血管和周围神经系统等分化的能力[1,2]。修剪腹外斜肌外膜制备成肌管(epimysium conduit,EMC)桥接5mm坐骨神经断端,与商品化的PUR导管相比,具有更好的神经再生作用[3]。研究发现,EMC不仅提供了利于神经再生的环境,还提供了神经再生的原料——肌源性干细胞。相比于骨髓干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞和胚胎干细胞等其它来源且均能够向神经系统分化的干细胞[4-9],肌源性干细胞具有分布广,易获取,取材创伤小等特点。但目前,EMC中的活细胞是如何影响神经轴突再生的尚无定论。因此,明确EMC中细胞成分对周围神经再生的影响及其可能的促神经再生机制具有重要意义。研究目的:1.制备脱细胞后的EMC的及其组织学评价2.制备细胞迁移抑制的EMC及其组织学评价3.不同细胞状态的EMC修复的坐骨神经及组织学和功能学评价研究方法和结果:1.制备脱细胞后的EMC的及其组织学评价方法:用显微外科技术获取EGFP小鼠背侧携带少量肌束的腹外斜肌外膜,将肌外膜分别经十二烷基硫酸钠(SDS)、液氮冻融、脱氧胆酸钠、核酸酶等处理,再用HE染色和MASSON染色检测观察EMC中是否存在细胞核及肌纤维等的损伤情况,最后再检验处理后的肌外膜是否能够制备成导管(即EMC)。结果:SDS处理肌外膜后仍有少部分细胞核残存;液氮冻融法损伤了肌外膜肌纤维,且残留大量细胞核无法洗脱;脱氧胆酸钠、DNase和RNase联合处理的肌外膜无细胞核存留,且细胞外基质保存完整,仍可缝合制备成EMC。2.制备细胞迁移抑制的EMC及其组织学评价方法:用显微外科技术获取EGFP小鼠背侧携带少量骨骼肌的腹外斜肌外膜,用不同剂量的X射线照射肌外膜,照射剂量每间隔5GY为一组,照射后做细胞贴壁迁移检测,计数肌外膜周围爬出的细胞数量,并对比观察照射剂量和细胞爬出数量的关系,最后再检验处理后的肌外膜是否能够制备成导管(即EMC)。结果:X射线照射能有效的抑制肌外膜内细胞迁移。从第4天开始,有细胞从肌外膜边缘迁出,一直观察到照射后15天。对比各组细胞数量发现,细胞爬出数量和照射剂量间存在负相关。对照组(0GY)爬出细胞数量最多,而照射剂量为35GY组爬出细胞最少,且肌外膜经照射后不影响EMC的制备。3.不同细胞状态的EMC修复的坐骨神经及组织和功能学评价方法:切断野生型小鼠3mm的坐骨神经,将制备好的脱细胞EMC、细胞抑制EMC和对照组EMC分别桥接神经断端;在术后第8周和16周,用显微外科技术将EMC再生的坐骨神经完整切断分离,并做免疫荧光、甲苯胺蓝和透射电镜检测;在神经功能学方面,检测再生神经相应的腓肠肌湿重,并做MASSON染色。结果:各组EMC中均有再生神经通过。在第8周时,各组EMC修复的神经无显著差异,仅在轴突数量上对照组的再生神经显著低于其余两组。但在第16周时,对照组EMC修复的神经在轴突数量和有髓神经鞘厚度均优于脱细胞和细胞抑制组;在神经功能方面,腓肠肌湿重各组间差异也与组织学结果一致,EMC对照组神经修复优于另外两组。研究结论:1.脱氧胆酸钠联合DNase酶和RNase酶可洗脱小鼠肌外膜的细胞核成分,并不影响其细胞外基质,保证处理后的肌外膜可缝合制备成导管。2.X射线能有效的抑制小鼠肌外膜中细胞的迁移能力,当照射剂量达到35GY时,可获得细胞迁移能力最低的肌外膜,且不影响肌外膜导管的制备。3.无论有无细胞的EMC均能修复小鼠3mm的坐骨神经断端,且含有活细胞的EMC修复的坐骨神经在组织学和功能学上较好,提示EMC中的细胞成分参与并促进了周围神经再生过程。