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犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)引起的一种急性传染病。此病以主要表现急性出血性胃肠炎和急性心肌炎。此病传染性强,发病率和死亡率高,是一种危害犬,特别是幼犬的一种重要传染性疾病。人们研究证明宿主细胞膜上的转铁蛋白受体( Transferrin receptor, TfR)是犬、猫等动物细小病毒侵入宿主细胞的受体。在感染过程中,病毒的衣壳蛋白VP2可以与宿主细胞膜TfR结合,在该受体介导下通过依赖dynamin和clathrin介导的内吞过程使病毒侵入宿主细胞。为了在分子水平上研究VP2与TfR的相互作用,需要制备VP2蛋白。为获得大量具有生物活性的VP2蛋白,我们选用真核表达系统。采用人的CD5信号肽构建了VP2分泌型表达载体,并利用CHO-K1细胞建立了VP2蛋白稳定表达细胞系。首先通过酶切从含有人CD5信号肽序列的质粒中将CD5信号肽片段切出,分离纯化酶切片段,并将其克隆到pcDNA3.1A的多克隆位点上,再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经过酶切鉴定筛选出阳性克隆,测序正确的重组质粒命名为pcDNA3.1-CD5sp。然后根据GenBank中CPV的VP2序列(AB120727)设计1对引物,通过PCR方法从含有VP2基因的质粒中扩增VP2基因的编码序列,并将其插入到pcDNA3.1- CD5sp载体中CD5信号肽的下游,使其与CD5信号肽序列融合,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。为了解构建的真核表达载体能否在真核细胞进行分泌性表达,首先经磷酸钙介导转染293T细胞,使其在真核细胞中进行分泌表达。通过测序,结果表明,构建的犬细小病毒VP2基因的分泌型表达载体结构正确,在293T细胞中的表达产物经Western-blot检测证明人的CD5信号肽序列能够介导犬细小病毒VP2基因在真核细胞进行分泌性表达。然后经脂质体介导,将重组pcDNA-CD5sp-VP2质粒载体和pcDNA3.1A空载体(对照)转染CHO-K1细胞,后通过G418加压筛选,筛选出稳定转染VP2基因的细胞株,经PCR检测证明VP2基因已经整合到CHO-K1细胞的染色体中;经RT-PCR、Western-blot分别检测VP2基因表达的mRNA和VP2蛋白,证明犬细小病毒VP2基因能够在CHO-K1细胞进行稳定性表达。这为下一步研究犬细小病毒VP2蛋白与宿主细胞的相互作用及VP2 DNA疫苗奠定了基础。