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泡沫病毒(Foamy Virus,FV)是逆转录病毒科(Retroviridae)泡沫病毒亚科(Spumaretrovirinae)的唯一成员,其在体外感染细胞会出现细胞病变反应(Cytopathic effect,CPE)而使细胞呈现泡沫状的多核巨细胞,故而得名。与其它逆转录病毒相比,FV基因组较长,宿主范围广泛,并且能够建立持续性感染而不产生任何症状。鉴于此,FV成为构建基因转移载体的理想材料。在原型泡沫病毒(Prototype Foamy Virus,PFV)基因转移载体的研究中,对其感染宿主细胞效率需要进行蛋白水平的检测,因此本研究采用基因工程技术克隆、表达、纯化PFV的整合酶(Integrase,IN)、前导肽(Leader peptide,LP)及反式激活因子Tas(Trans-activator of spumaviruses),并制备其抗血清,为PFV基因转移载体蛋白水平的定性、定量检测提供支持,同时为PFV结构蛋白研究及相关功能、机制方面的研究奠定基础。本研究首先采用DNAStar软件包中的Protean软件对目的蛋白IN、LP和Tas进行抗原表位分析,结果显示这三个片段均含有潜在的抗原表位,可作为抗原来免疫制备抗血清。以PFV基因组全长克隆载体pHSRV13质粒为模板,设计引物,分别PCR扩增LN、LP及tas基因序列,构建pET-32a-IN、pET-32a-LP及pET-32a-tas表达载体;并将其分别转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plysS、E.coli Transetta(DE3)中,IPTG 诱导表达 IN、LP 及 Tas 三种融合蛋白,产物经SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况,并进行可溶性分析及条件优化。所得IN、LP及Tas融合蛋白经变性后,跑胶、切胶回收,免疫新西兰大白兔以诱导产生免疫反应,从而得到IN、LP及Tas蛋白的抗血清。同时,对PFV全病毒粒子进行浓缩、免疫新西兰兔,制备PFV全病毒粒子的抗血清。对制备的抗血清通过ELISA进行滴度检测,同时采用Western blot进行特异性检测。最后,对抗血清进行IgG纯化,并且用纯化后的抗血清对感染病毒的细胞、转染真核表达载体的细胞进行蛋白水平的检测。本实验取得的主要研究成果如下:1.采用DNAStar软件对IN、LP及Tas蛋白序列进行分析,结果表明可能为抗原表位的区段分别为:IN蛋白序列中的20-28 aa、127-137 aa、273-287 aa区段;LP蛋白序列中的64-67 aa、93-100 aa区段;Tas蛋白序列中的45-56aa、118-128 aa、176-205 aa、247-269 aa区段。2.PCR扩增得到片段大小分别为1092 bp、381 bp、903 bp的IN、LP、tas基因,经酶切、连接、转化、鉴定及测序,结果显示目的基因片段与PFV基因组全长克隆载体pHSRV13上的序列一致,即成功构建带有His融合标签的原核表达质粒 pET-32a-IN、pET-32a-LP 及 pET-32a-tas。3.pET-32a-IN、pET-32a-LP 及 pET-32a-tas 在 E.coli Transetta(DE3)中经 IPTG诱导均获得高效表达,获得相对分子质量Mr分别为58 KD、36 KD、54 KD的IN、LP、Tas融合蛋白,且其均以包涵体形式存在。4.IN、LP、Tas包涵体经变性后电泳、切胶免疫新西兰大白兔,获得抗血清。同时,IN、LP、Tas包涵体经变性后通过镍柱纯化,进而获得高纯度的融合蛋白。ELISA检测显示IN抗血清、LP抗血清及Tas抗血清效价均可达1:2 048 000,Western blot检测证实三种抗血清均能与其相应目的蛋白发生特异性结合。5.浓缩PFV全病毒粒子后免疫新西兰大白兔,获得PFV全病毒抗血清,Western blot检测表明该抗血清可特异性结合PFV结构蛋白。6.对抗血清中的免疫球蛋白IgG分离纯化,结果得到IgG含量分别为2.517μg/μL、1.860μg/μL、2.515μg/μL、2.666μg/μL 的 IN 抗血清、LP 抗血清、Tas 抗血清、PFV全病毒抗血清,纯化效果较好。7.对感染PFV的细胞、转染真核表达载体pCI-Env、pCI-Tas的细胞进行蛋白水平的检测,结果表明本实验制备的抗血清均能够与相应病毒蛋白发生特异性结合。研究结果表明本研究与预期相符,成功获得高效价、具有较好免疫活性的抗血清。本实验为进一步进行PFV载体的检测和PFV结构蛋白研究及相关功能、机制方面的研究奠定基础。