重楼为中药临床常用饮片之一,2020年版《中国药典》规定,百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或七叶一枝花P.polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara为中药重楼的基原植物。历代本草记载七叶一枝花（即华重楼）曾在相当长时期内作为重楼药材的来源,明代之后七叶一枝花和云南重楼（即滇重楼）才同时出现。虽同为药典基原植物,目前对于重楼药效物质的研究重点主要集中于滇重楼,对华重楼的关注存在不足,此外,课题组前期研究发现华重楼与滇重楼具有不同的甾体皂苷轮廓,（原）偏诺皂苷和（原）薯蓣皂苷分别作为华重楼和滇重楼的主要成分,甾体皂苷不同亚组分的活性是否不同少有研究。甾体皂苷作为重楼主要活性成分,根茎需要6～7年的生长时间含量才能达到药用标准,针对甾体皂苷合成途径中关键基因的解析是调控活性成分累积和明确重楼两基原植物存在化学轮廓差异的基础。基于以上问题,本论文开展以下研究:一、基于离线二维液相（2D-LC）技术的华重楼与滇重楼化学成分表征针对常规质谱分析中成分共流出和微量成分难暴露的问题,本研究构建了离线二维液相分离体系,通过串联不同分离机制的色谱柱,优化色谱分离条件,样品先经过HILIC柱分离,根据色谱图出峰情况分段收集,再经过C18色谱柱分析。与一维液相串联质谱分析相比,离线2D-LC极大地提高了峰容量,减少了成分共流出情况,同时使微量成分得到充分暴露,最终从华重楼和滇重楼的根茎提取物中鉴定了 444个化合物。鉴定的成分包括394个甾体皂苷、5个植物蜕皮激素、14个含氮化合物和6个苯丙糖苷类成分,其中306个为潜在的新化合物,分别包含了多羟基甾体皂苷和呋甾皂苷成分类别。基于分段样品的成分比较发现,华重楼与滇重楼在呋甾组分段同样存在成分类别的差异,华重楼以原偏诺皂苷类为主,滇重楼以原薯蓣皂苷类为主。二、华重楼化学成分与生物活性研究对呋甾皂苷和多羟基甾体皂苷含量较为丰富的华重楼根茎乙醇提取物大孔吸附树脂50%乙醇洗脱部分开展了 LC-MS导向的化学成分分离。采用硅胶真空柱色谱,ODS开放柱色谱,Flash快速制备色谱,制备液相色谱等分离纯化手段,从中分离出26个化合物,通过化合物理化性质和各种光谱数据对分离得到的化合物进行结构鉴定,包括17个甾体皂苷类,9个胆甾烷类。化合物1-3和6-15为新化合物,化合物4,5为前期通过液质联用技术推测的新成分,本次为首次通过核磁数据进行准确鉴定。在鉴定的化合物中,包含1个新的呋甾皂苷、7个新的多羟基甾体皂苷,一定程度上验证了质谱鉴定的成分类别。采用LPS诱导的RAW264.7细胞模型、人肝癌HepG2细胞和体外诱导血小板聚集实验对部分化合物的抗炎、抗肿瘤和止血活性进行了评价,结果显示胆甾烷成分20和呋甾类成分24呈现出了一定的NO抑制活性,IC50分别为61.35 μM和37.23 μM;4个化合物5,18,19和24对HepG2细胞呈现出中等的细胞毒性,IC50分别为22.35、9.43、15.36和24.54 μM;重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、17-羟基纤细薯蓣皂苷和重楼皂苷Ⅱ在50μM剂量下具有直接诱导血小板聚集活性。三、华重楼甾体皂苷亚组分的制备和活性评价通过成分分离进一步明确了华重楼甾体皂苷中呋甾组分段的成分组成,为了分析不同类别甾体皂苷的药理活性是否存在差异,采用大孔吸附树脂富集华重楼总皂苷,Flash快速制备色谱对其中的呋甾、偏诺和薯蓣组分进行快速制备。基于重楼传统功效和现代药理研究,以小鼠断尾实验和诱导血小板聚集实验评价了不同组分的止血活性;以LPS刺激的RAW264.7细胞模型和COX-2抑制实验评价了不同组分的抗炎活性。结果显示,华重楼总皂苷经Flash快速制备色谱能够实现呋甾、偏诺和薯蓣组分的快速分离。止血实验表明各组分均能显著缩短小鼠断尾出血时间,以偏诺组分最好,能不同程度地缩短凝血酶时间（TT）的时间,但对凝血酶原时间（PT）和纤维蛋白原（FIB）无影响;偏诺组分在25μg·mL-1的剂量下能直接诱导血小板的聚集,而薯蓣组分仅在50 μg·mL-1的剂量下有效,呋甾组分在50μg·mL-1的剂量下无效。抗炎实验表明各组在25 μg·mL-1的剂量下均对COX-2有抑制作用,以呋甾组分最好,但对LPS诱导的RAW264.7细胞的NO和TNF-α的释放无影响。通过不同组分的活性评价,偏诺组分的止血活性优于薯蓣组分,而呋甾组分体外不能诱导血小板聚集,但在体内同样具有止血活性。因此,呋甾组分的体内外止血活性差异的原因是下一步的研究重点。四、华重楼甾体皂苷生物合成途径分析和关键基因筛选利用植物代谢组学技术对华重楼和滇重楼根茎、茎和叶进行了分析,进一步明确了重楼两基原植物在化学轮廓上的差异。华重楼根茎和叶样品的OPLS-DA分析表明叶中除了较为丰富的黄酮类成分之外,甾体皂苷类别以薯蓣皂苷类为主,而根茎中以偏诺皂苷类为主,提示能从华重楼不同组织部位的转录组数据中筛选偏诺皂苷合成的CYP450基因。对华重楼须根、茎、叶和种子的转录组测序获得了125.16Gb的数据,经denovo组装后从中鉴定出167条参与甾体皂苷生物合成上游途径的基因,涉及22个代谢酶。基于Pfam数据库的注释鉴定了90条全长CYP450酶的基因序列,从中能够发现与已知功能的CYP450酶相似的基因序列。通过分析不同组织部位中CYP450基因的表达情况,与叶相比有6条在须根和种子中高表达的基因被筛选出来,为下一步基因功能验证奠定基础。综上所述,本研究进一步丰富了华重楼药效物质的组成,对不同类型甾体皂苷的药效评价结果可为药材的质量控制提供参考。从华重楼不同组织部位的转录组数据中筛选获得了参与甾体皂苷生物合成的基因,可为下一步的基因功能验证和揭示重楼药材品质形成的机制提供支撑。