引起奶牛乳腺炎的原因复杂多样,金黄色葡萄球菌是其中重要的病原之一。目前生产上针对金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳腺炎的防治有抗生素、中草药以及灭活疫苗等,但是抗生素的过度使用会产生耐药性甚至“抗性奶”,危害公共卫生和人类身体健康,而中草药治疗用量大,成本高,灭活疫苗等预防效果也不理想。随着分子生物学和免疫学的发展,抗体制剂受到越来越多研究者的亲睐,尤其是小分子单链抗体,不仅保留了“Y”形抗体完整的抗原结合位点,且具有分子量小,免疫原性低,组织穿透能力强等优点,也备受大家关注。为探寻治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,本研究将其原核表达产物已显示具有一定治疗效果的8个针对牛源金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)的编码基因插入到pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1-scFv。首先验证单链抗体真核质粒的表达特性,将其注入小鼠乳腺内,经Western blot验证真核质粒从第1 d开始表达,第5 d达到表达高峰,在此基础上继续研究真核表达scFv对小鼠乳腺炎的治疗作用。具体方法是将混合的真核表达质粒经第四对乳腺导管注入到处于泌乳期的乳腺炎模型小鼠的乳腺中,以通过scFv在小鼠乳腺内的表达来抑制细菌对乳腺上皮细胞的粘附从而达到防治乳腺炎的目的。结果显示,与阴性对照组相比,scFvs治疗组乳腺内的细菌数量显著减少(p<0.05),乳腺组织较完整,减少了炎性细胞的浸润,且TNF-α、IL-6和IL-17的含量均显著降低(p<0.05)。表明pcDNA3.1-scFvs对小鼠乳腺炎可能具有一定程度的保护作用。为了进一步验证牛源单链抗体对奶牛乳腺炎的治疗效果,真核表达质粒经无针注射器注射到7个经鉴定患隐性乳腺炎的乳区内,注射2次pcDNA3.1-scFvs的混合质粒,每次600μg,间隔48 h。注射治疗后,奶样中细菌数量从第3天开始显著减少(p<0.05),有2个乳区奶样检测结果为阴性,判定为治愈,治愈率为28.57%;5个乳区奶样CMT检测结果由++变为+,判定为治疗有效,有效率为71.43%。表明pcDNA3.1-scFvs对奶牛隐性乳腺炎可能具有一定程度的治疗作用。本文还对11144号和14192号两头牛的奶样、尿样和粪样进行质粒残留PCR检测,发现均未扩增出条带。表明奶牛乳腺内的pcDNA3.1-scFvs不会通过牛奶、尿液和粪进入到环境中,不会对环境造成影响。总之,本研究通过pcDNA3.1-scFvs重组真核质粒治疗奶牛乳腺炎的研究,旨在为基因治疗奶牛乳腺炎提供一定的理论依据,也为进一步研究防治奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂探索了新途径。