论文部分内容阅读
嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A caldus)是一种中度嗜酸嗜热的化能自养硫氧化细菌,革兰氏阴性,能够以单质硫,硫代硫酸盐,连四硫酸盐,亚硫酸盐,硫化物为能源进行生长。最适生长温度为45 ℃,最适pH为2-2.5。A.caldus在生物浸矿,煤的生物脱硫,污泥处理等方面有着重要作用。σ因子是细菌转录调控机制中的关键,σ54是一类独特的转录因子,由rpoN基因编码。在A.caldus MTH-04中,σ54具体调控哪些基因并不明确,转录调控网络还不健全。硫代谢是A.caldus 重要的生理特征,其中连四硫酸盐介导的硫代硫酸盐代谢途径(S41Ipathway)是硫代谢中的关键步骤,通过该途径可以进行硫代硫酸盐和连四硫酸盐的相互转化。本研究围绕A.caldus中σ54因子和S41 pathway开展研究,主要包括以下几部分内容。一、A.caldus MTH-04中σ54调控基因的分析。因为A.caldus MTH-04基因组注释不完整,本文通过两种方式进行σ54调控的基因的生物信息学分析。(1)由于A.caldus MTH-04与A.caldus SM-1的基因组序列具有高度相似性,且A.caldus SM-1的基因组研究比较早,注释较为完整,通过对A.caldus SM-1中σ54调控的基因进行寻找,并将这些基因序列在A.caldus MTH-04基因组中进行比对,找出A.caldus MTH-04中可能的σ54调控的基因7个,并预测这7个基因的的启动子区域。(2)根据转录起始时RpoN蛋白特异性识别启动子序列-12(GC)/24(GG)区具有高度保守性,使用Virtual Footprint在线分析软件对A.caldus MTH-04基因组中可能的σ54调控的启动子序列进行分析,发现13个可能的RpoN结合的启动子序列,并找出这13个启动子对应基因。二、σ54因子与调控基因的体外结合能力分析。异源表达纯化获得σ54因子的RpoN蛋白,进而通过凝胶阻滞分析RpoN蛋白与预测的启动子片段的结合作用,鉴定出四个能够与RpoN蛋白结合的启动子序列,相应的基因为orf2328,orf2805,orf1640,orf2486,分别负责编码ATP依赖性Clp蛋白酶,未知功能蛋白,接合转移信号肽酶TraF,Sox I双组分系统调控tspR蛋白。三、σ54调控基因的转录水平分析。利用RT-qPCR在转录水平上分析σ54过表达对基因转录水平影响,发现rpoN过表达导致 orf1479,orf1638,orf2129,orf0213,orf0969,orf0019,orf2237,orf1076,orf0414,orf2330,orf0021,orf0211下调,orf2803,orf2139,orf1074,orf2486上调,结果暗示σ54与这些基因间的紧密联系。四、连四硫酸盐代谢途径的研究。在本实验室已有tetH敲除株的基础上,在单质硫培养和K2S406混合能源底物时,分析细胞生长、代谢情况以及硫代网络的变化过程。发现硫能源底物浓度的不同对菌体的生长具有明显的影响作用;tetH敲除株培养液中的连四硫酸盐浓度会随着细胞的生长而减低或最终消失。转录分析表明突变株中一下硫代谢相关基因的转录下降。基于相关研究结果,推测A.caldus中可能存在其它未知的连四硫酸盐代谢或转运途径。