植物耐铝相关GmNramp5Like基因和OsMGT1基因的克隆与功能验证

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铝元素非植物所必需的矿质营养元素,却普遍存在土壤中。世界上潜在可耕地面积的50%以上为酸性(pH<5)土壤。在酸性土壤中,微摩尔浓度三价离子形态存在的铝离子就会限制植物根系的生长,影响植物根系对水分和养分的吸收,扰乱植物的许多其它功能包括根毛的伸长、矿质营养元素的摄取、体外苗的再生以及细胞间的传输等。铝离子对作物的生长起极严重的限制作用,是仅次于干旱的非生物逆境胁迫。在过去20多年里,许多重要农作物对铝毒的抵抗/耐受能力越来越强,大部分归功于遗传学与分子生物学的运用。通过转基因技术增强植物对铝毒的抗性,对提高酸性土壤的利用率和作物生产具有重大意义。本实验克隆了2个植物耐铝相关的基因,然后分别利用植物生长系统和酵母生长系统对目的基因的功能进行研究,获得以下实验结果:1)以本实验室前期研究中已克隆并保存在中间载体上的编码水稻镁离子转运蛋白的OsMGT1基因为模板,利用高保真酶进行PCR扩增得到5’和3’端含特定酶切位点的目的基因:而后利用常规分子生物学方法将该目的基因构建到含CaMV 35S启动子的pCambia1301植物表达载体上。经PCR检测和双酶切验证表明植物表达载体pCambia1301-35S::OsGT1构建成功。2)利用农杆菌介导的花序浸润法,将构建的植物表达载体pCambia1301-35S::OsMGT1转化野生型(Col-0)和双突变体型(ALMT/MATE)拟南芥;经抗生素筛选和转基因植株的PCR检测,表明OsMGTl基因已经成功整合到拟南芥基因组中。待转基因种子自交纯合后,即可进行耐铝性相关的试验与分析。3)利用同源基因克隆的方法成功从“大豆"Williams 82"中克隆了水稻铝转运蛋白基因OsNratl的同源基因GmNramp5Like;其编码区全长1635 bp,编码544个氨基酸;基因组序列全长4043 bp含13个外显子,12个内含子;该基因在大豆根系中的表达受Mg2+、Mn2+和Al3+的诱导;GmNramp5Like基因与水稻OsNratl基因、拟南芥AtNrampl基因和AtNramp6基因相似性较高;TMHMM在线软件预测GmNramp5Like基因编码蛋白具有12个明显的跨膜结构域。4)成功构建了酵母表达载体pYES2-GmNramp5Like,并将新构建的酵母表达载体pYES2-GmNramp5Like和对照空载体pYES2转入酵母菌株By4741中;酵母耐铝试验结果表明:与转化空载体pYES2的对照相比,转化pYES2-GmNramp5Like的酵母菌株对铝的耐受性显著提高。GmNramp5Like基因的表达可以提高酵母的耐铝性,进而推测过表达GmNramp5Like基因可能会对缓解植物Al3+毒害起到一定的作用。
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