内生真菌枫香拟茎点霉（Phomopsis liquidambari）是一株分离自重阳木（Bischofia polycarpa）茎内皮的广谱内生真菌。前期研究表明枫香拟茎点霉可体外降解木质素和花生连作土壤中的有害酚酸类物质,改善土壤理化性质和微生物群落,有效促进宿主植物水稻和花生的氮代谢和生长。此外,次级代谢产物信息分析发现,枫香拟茎点霉基因组中含有91个次级代谢产物生物合成基因簇。然而,遗传操作工具的缺乏限制了我们对枫香拟茎点霉与其宿主植物间相互作用机制的深入研究,并且限制了未来对次级代谢产物生物合成基因簇的探究。本研究中,我们在枫香拟茎点霉体内构建了基于CRISPR/Cas9的靶向基因敲除系统,并在原有的基础上对构建的系统进行了优化。应用该系统我们对枫香拟茎点霉的mapkk基因进行了靶向敲除,探究了mapkk基因的缺失对枫香拟茎点霉表型生长的影响。接着我们对野生型枫香拟茎点霉和Δmapkk菌株进行了转录组测序,在转录组层面探究了mapkk基因的缺失影响Δmapkk菌株表型生长的原因,并且对信号通路相关基因的表达情况进行了分析,推测Δmapkk菌株可能对水稻的生长产生不同于野生型菌株的影响。最后我们将野生型枫香拟茎点霉和Δmapkk菌株分别接种水稻,探究了mapkk基因的敲除对枫香拟茎点霉-水稻共生体系的影响。本研究中,我们基于CRISPR/Cas9技术在枫香拟茎点霉体内构建了高效的靶向基因敲除系统。首先,我们构建了CRISPR/Cas9敲除质粒并进行western实验确定了Cas9蛋白的表达。接下来我们选定尿嘧啶合成通路中的关键基因乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶（ura3）,使用构建的系统对其进行靶向敲除获得了一株Δura3突变株,该突变株无法在普通PDA平板上生长,回补野生型菌株的ura3基因后表型恢复,表明ura3基因被成功敲除。接下来我们设计了一条新的g RNA序列并分别将含有不同长度同源臂的质粒转化进入枫香拟茎点霉对ura3基因进行了靶向敲除,结果显示含有新g RNA的质粒敲除效率从原来的0.93%提高到了约20%,最适同源臂长度为400-bp和1000-bp,敲除效率约为22.5%。使用构建的CRISPR/Cas9敲除系统,我们还在ku70或ku80基因被敲除的基础上对ura3基因进行了敲除,结果显示ura3基因的敲除效率分别上升至66.7%或62.5%。最后我们利用构建的CRISPR/Cas9系统将红色荧光蛋白基因m Cherry敲入基因组上的ku70位点,使用荧光显微镜成功观察到红色荧光。本课题组前期研究表明MAPK信号通路在枫香拟茎点霉-水稻共生体系中发挥着重要的作用。为了探究MAPK信号通路对枫香拟茎点霉与水稻间相互作用的影响,我们利用上述构建的基于CRISPR/Cas9的遗传操作系统对枫香拟茎点霉的mapkk基因进行靶向敲除,获得了Δmapkk突变菌株。Δmapkk菌株在PDA平板上生长缓慢,菌丝致密紧贴培养基且呈黄褐色,在MM平板上则完全无法生长,显微镜观察发现Δmapkk菌株菌丝生长发生交联,细胞壁变得脆弱易断。转录组数据显示Δmapkk菌株N-聚糖生物合成相关基因的表达整体受到抑制,MAPK信号通路中大量基因的表达受到了影响。在后续水培实验中,我们发现Δmapkk菌株在水稻体内定殖量降低,并对水稻的生长产生抑制作用,诱导水稻根部活性氧迸发,同时水稻根部的几丁质酶活和葡聚糖酶活被显著诱导,表明mapkk基因功能的缺失可能破坏了枫香拟茎点霉和水稻间的信号识别,并且可能诱发了水稻的防御机制。