基于代谢控制育种技术选育深黄被孢霉高产γ-亚麻酸菌株

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γ-亚麻酸(Gamma-linolenic acid,简称GLA)是人体内的一种必需多不饱和脂肪酸,它是前列腺素和白细胞介素的前体物质,具有广泛的生理作用和显著的药理作用。与从动植物中提取GLA相比,微生物发酵法生产GLA具有明显的优势和潜力,因此微生物发酵法生产GLA越来越受到人们的重视。本文以深黄被孢霉(Mortierella Isabellina)AS3.3410为出发菌株,根据菌株油脂合成代谢调节关键节点建立抗丙二酸法和TTC法筛选模型,抗丙二酸法筛选紫外诱变后高产油脂深黄被孢霉菌株,经超声波辅助提取法提取油脂复筛,获得突变株U-0116,摇瓶发酵其生物量、油脂含量、油脂产量和GLA产量分别为19.86g/L、70%、13.92g/L、699.70mg/L,与出发菌株相比分别提高了18.85%、16.67%、38.58%、26.27%。研究发现,在氮离子注入能量为30KeV,注入剂量为48×1014ions/cm2时,诱变效果最好。在这个条件下,对高产油脂突变株U-0116进行氮离子注入诱变,TTC法筛选高产不饱和脂肪酸菌株,采用气相复筛获得高产GLA菌株I-0281,其GLA产量为899.80mg/L,相比原始菌株提高了60.27%。利用单因素试验及中心组合试验,采用500mL三角瓶对突变株I-0281的发酵氮源、葡萄糖浓度、碳氮比、MgSO4和初始pH等条件进行了探索和优化,研究发现突变株I-0281发酵生产GLA的最佳培养基为:葡萄糖浓度为77g/L,酵母浸粉0.45g/L,硝酸钾0.98g/L,硫酸镁0.2g/L,磷酸二氢钾2g/L,柠檬酸钠2g/L,最佳初始pH为6.0。在深黄被孢霉发酵过程中,通过外源加入柠檬酸、乙酸、苹果酸、吐温-80和甜菜碱等化合物研究了它们对GLA合成的影响,结果表明:发酵至第4d添加0.02%的苹果酸,有利于生物量的提高, GLA产量提高7.16%,但对油脂含量和GLA/TFA没有明显的影响;发酵至5d添加0.02%的乙酸或苹果酸,均对生物量影响不大,但均促进了油脂的合成,GLA产量分别提高了6.26%、10.24%。添加适量的吐温有利于提高生物量、油脂产量和GLA产量,当吐温-80添加量为0.21%时,GLA产量达到最大值,比对照提高了10.91%。低浓度的甜菜碱对深黄被孢霉细胞生长作用不明显,高浓度的甜菜碱对细胞生长和油脂的积累有很明显的抑制作用,然而GLA/TFA却反而会增加。
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