背景:原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一类在全球范围内发病率和死亡率都极高的致死性疾病[1]。中国HCC新发病例和死亡病例都居世界首位,因此具有侵袭、转移及复发率高等特点的HCC严重威胁中国居民健康[1-4]。尽管早期/中期HCC患者采用手术切除和局部疗法,晚期HCC患者采用系统疗法,但HCC患者的5年生存率仍然只有7%,其主要原因是肿瘤的复发、转移和药物耐受。多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）具有抗血管生成和抗肿瘤细胞增殖的作用,是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准的首个HCC分子靶向药物。然而,由于索拉非尼耐药,患者从索拉非尼治疗中获得的中位生存优势不到3个月[5,6]。尽管仑伐替尼（Lenvatinib）和FOLFOX4等新的一线靶向药物已被批准用于HCC,但临床试验表明,它们对总生存期的延长并不比索拉非尼更好[7,8],索拉非尼仍是晚期HCC患者临床治疗的金标准,因此深入研究索拉非尼耐药机制至关重要。已知索拉非尼耐药与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）、肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）和肿瘤微环境密切相关[9]。而Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase,Rho GTPase）作为EMT相关信号通路的上游调控因子[10-12],诱导肝癌索拉非尼耐药[13,14],因此被认为是索拉非尼耐药治疗的有效靶点。Rho GTP酶是Ras GTP酶（Ras guanosine triphosphatase,Ras GTPase）超家族中一小部分GTP酶（Guanosine triphosphatase,GTPase）,在基因调控、细胞周期和细胞迁移等细胞进程中发挥重要作用[15-17]。大多数Rho GTPases充当分子开关,在三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate,GTP）结合的活化形式和二磷酸鸟苷（Guanosine diphosphate,GDP）结合的非活化形式之间循环。Rho GTPases的活性由鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor,GEF）增加,该因子促进结合GDP的释放和随后更丰富的GTP的结合。而GTP酶激活蛋白（GTPase activating protein,GAP）刺激GTP的水解降低Rho GTPases活性[17]。然而,由于Rho GTPases和Ras GTPases球状结构几乎没有小分子结合位点、对GTP或GDP结合的高亲和力,以及GTP在细胞中可用的微摩尔水平,它们之前被认为是“不可成药的”[18,19]。因此,通过竞争性抑制GEFs与其结合分子之间的相互作用来靶向Rho蛋白鸟嘌呤核苷酸交换因子（Rho guanine nucleotide exchange factors,Rho GEFs）被认为是目前癌症治疗中更有效的Rho GTPases抑制剂的选择[20]。本课题通过人类蛋白质图谱数据库（The Human Protein Atlas）和癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）以及HCC患者队列,发现普列克同源包括Rho GEF结构家族成员5（Pleckstrin homology and Rho GEF domain containing G5,PLEKHG5）在HCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织,因此其可能与HCC的发生发展有关。随后,我们发现在索拉非尼耐药的HCC细胞及耐药患者标本中PLEKHG5表达水平增高,提示其可能在肝癌索拉非尼耐药中发挥重要作用。对索拉非尼耐药细胞进行转录组测序（RNA-sequencing,RNA-seq）,以进一步解析PLEKHG5的翻译后修饰和其激活Rho GTPases诱导索拉非尼耐药的分子机制。本研究从临床HCC患者队列及索拉非尼耐药细胞中鉴定了功能基因PLEKHG5,对PLEKHG5在肝癌发生发展及索拉非尼耐药中的作用提供分子机制,有望为临床索拉非尼耐药患者提供新的治疗靶点及用药策略。实验方法:1.验证PLEKHG5在HCC中发挥促癌作用。利用人类蛋白质图谱数据库和TCGA数据库以及从重庆医科大学附属第一医院肝胆外科收集到的HCC标本对PLEKHG5基因进行深度挖掘,明确其在HCC组织中的表达水平,并分析其与患者预后的相关性。利用CRISPR/Cas9系统构建PLEKHG5敲低（PLEKHG5 knockdown,PLEKHG5 KD）及PLEKHG5过表达（PLEKHG5 overexpression,PLEKHG5 OE）的HCC细胞模型,通过细胞增殖实验检测PLEKHG5对HCC细胞增殖能力的影响及对索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效的影响。2.探索PLEKHG5诱导索拉非尼耐药的分子机制。通过低剂量索拉非尼药物诱导6个月以上,构建MHCC97H和PLC/PRF/5索拉非尼耐药（sorafenib resistant,SR）细胞模型（MHCC97H SR,PLC/PRF/5SR）,并通过IC50实验和细胞凋亡实验验证细胞对索拉非尼的耐药性。对MHCC97H SR和MHCC97H细胞进行RNA-seq,对差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG）进行基因本体论（Gene ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析,发现差异表达基因主要富集在Rho GTPase活性、Rho GEF活性、组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）活性、PI3K/AKT和MAPK等信号通路。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和Western blot实验对索拉非尼耐药细胞中PLEKHG5表达上调及Rac1/AKT/NF-κB信号通路的激活进行验证。通过Western blot验证PLEKHG5过表达及敲低对Rac1/AKT/NF-κB信号通路的调控。采用NSC23766抑制PLEKHG5与Ras相关C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）的相互作用,通过细胞增殖实验和克隆形成实验观察NSC23766联合索拉非尼对HCC细胞增殖的影响,并通过Western blot观察NSC23766联合索拉非尼对Rac1/AKT/NF-κB信号通路的影响。3.探索组蛋白去乙酰化酶2（Histone deacetylase 2,HDAC2）调控PLEKHG5乙酰化修饰影响其蛋白稳定性的分子机制。通过免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）实验检测索拉非尼耐药细胞和敏感细胞中PLEKHG5乙酰化修饰水平。使用HDAC活性检测试剂盒检测索拉非尼耐药细胞和敏感细胞中HDACs的活性,探索调控PLEKHG5乙酰化修饰的HDACs。通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）和细胞免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验检测HDAC2与PLEKHG5的共定位及相互作用。通过免疫沉淀—质谱联用（Immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS）鉴定PLEKHG5乙酰化修饰位点。利用CRISPR/Cas9系统构建HDAC2敲除（HDAC2knockout,HDAC2 KO）细胞模型。通过IP检测不同组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor,HDACi）处理及HDAC2敲除对PLEKHG5乙酰化修饰的影响,验证HDAC2是PLEKHG5的生理性去乙酰化酶。通过环己酰亚胺（Cycloheximide,CHX）追踪实验检测HDAC2敲除及PLEKHG5乙酰化修饰位点突变对PLEKHG5蛋白稳定性的影响。4.体内外验证抑制HDAC2增强索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效。体外HDAC2敲除或采用HDAC2特异性抑制剂Santacruzamate A（CAY10683）与索拉非尼联合治疗,通过细胞增殖实验、克隆形成实验和细胞凋亡实验检测细胞增殖速率和凋亡水平的变化,并通过Western blot检测PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路的变化。在小鼠原位肝癌模型中观察HDAC2敲除联合索拉非尼对肿瘤增殖的影响:通过腹腔注射二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）和四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4）构建C57BL/6小鼠原位肝癌模型。设置索拉非尼药物治疗组,观察肝脏特异HDAC2敲除小鼠(Liver-specific HDAC2 knockout C57BL/6 mice,HDAC2LKO)与野生型小鼠（Wild-type,WT）肿瘤体积及结节数的变化。通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化。通过Western blot和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）检测PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路的变化。在裸鼠皮下成瘤模型中观察HDAC2特异性抑制剂CAY10683联合索拉非尼对肿瘤增殖的影响:皮下注射MHCC97H细胞,设置对照组、索拉非尼治疗组、CAY10683治疗组和索拉非尼联合CAY10683治疗组,观察肿瘤体积的变化。通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化。通过Western blot和IHC检测PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路的变化。结果:1.PLEKHG5在肝癌中发挥促癌作用。通过分析人类蛋白质图谱数据库、TCGA数据库及收集到的HCC患者标本,发现PLEKHG5在HCC中表达上调并与患者预后不良相关。通过PLEKHG5过表达及敲低细胞模型,我们发现PLEKHG5过表达促进HCC细胞增殖并降低索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效,而PLEKHG5敲低则结果相反,提示PLEKHG5在肝癌中发挥促癌作用。2.PLEKHG5激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路诱导索拉非尼耐药。MHCC97H SR和PLC/PRF/5 SR细胞对索拉非尼的IC50相较敏感细胞增高一倍（MHCC97H SR:22.29 vs 10.99μM;PLC/PRF/5 SR:12.78vs 5.067μM）,不同索拉非尼浓度下耐药细胞的凋亡率明显低于敏感细胞,提示肝癌索拉非尼耐药细胞成功构建。RNA-seq结果显示差异表达基因主要富集在Rho GTPase活性、Rho GEF活性、HDAC活性、PI3K/AKT和MAPK等信号通路。q RT-PCR和Western blot结果证实索拉非尼耐药细胞中PLEKHG5表达水平升高及Rac1/AKT/NF-κB信号通路激活。此外,PLEKHG5过表达激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路而PLEKHG5敲低抑制Rac1/AKT/NF-κB信号通路,说明PLEKHG5激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路诱导索拉非尼耐药。使用NSC23766抑制PLEKHG5与Rac1的相互作用,抑制Rac1/AKT/NF-κB信号通路,从而抑制HCC细胞增殖并增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性,提示PLEKHG5可能是一个潜在的索拉非尼耐药治疗新靶点。3.HDAC2调控PLEKHG5乙酰化修饰影响其蛋白稳定性。IP实验显示,索拉非尼耐药细胞中PLEKHG5蛋白表达升高且乙酰化修饰水平降低。在索拉非尼耐药细胞中HDAC2活性明显增强。进一步实验发现,HDAC2与PLEKHG5在细胞核内共定位且HDAC2与PLEKHG5的普列克同源（pleckstrin homology,PH）结构域相互作用。IP-MS鉴定PLEKHG5的PH结构域内有3个高保守赖氨酸乙酰化修饰位点,提示PLEKHG5的乙酰化修饰与HDAC2有关。IP实验表明,仅在抑制HDAC2时PLEKHG5乙酰化修饰水平升高,说明HDAC2是PLEKHG5的生理性去乙酰化酶。CHX追踪实验显示,HDAC2调控PLEKHG5的PH结构域内三个赖氨酸位点乙酰化修饰影响PLEKHG5蛋白稳定性。4.抑制HDAC2增强索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效。体外实验表明,HDAC2敲除或CAY10683与索拉非尼联合治疗抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路,从而明显抑制HCC细胞增殖,促进HCC细胞凋亡。小鼠原位肝癌模型显示,HDAC2敲除联合索拉非尼抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路,从而明显抑制肿瘤体积大小和肿瘤结节数。裸鼠皮下成瘤模型显示,CAY10683协同索拉非尼抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路,从而明显抑制肿瘤体积大小。因此,抑制HDAC2联合索拉非尼可能是治疗肝癌索拉非尼耐药患者的新策略。结论:研究结果揭示了PLEKHG5是HCC和索拉非尼耐药的初始诱导因子,通过激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路促进HCC发生发展并诱导索拉非尼耐药。HDAC2作为PLEKHG5的生理性去乙酰化酶,其与PLEKHG5共定位,调控PLEKHG5的PH结构域内三个赖氨酸位点的乙酰化修饰,影响PLEKHG5蛋白稳定性。体内外HDAC2敲除或药物抑制HDAC2,抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路,增强索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效。本课题阐述了HDAC2活性增高及PLEKHG5表达增高诱导肝癌索拉非尼耐药的具体分子机制,对HDAC2和PLEKHG5参与索拉非尼耐药提供理论支持,有望为临床索拉非尼耐药患者提供新的疗法。