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光呼吸是植物体吸收分子氧并伴随着从有机化合物中释放二氧化碳的光依赖吸收过程,发生的场所包括叶绿体、过氧化物酶体、线粒体。光呼吸反应由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶催化发生。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶是一种双功能酶,它既可以催化核酮糖-1,5-二磷酸与CO2发生羧化反应又可以催化其与O2发生加氧反应。羧化反应的产物是磷酸甘油酸,最终进入卡尔文循环转变成糖;加氧反应的产物是等量的磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸,磷酸乙醇酸脱磷酸成乙醇酸。乙醇酸对植物的生长有胁迫作用,大量乙醇酸的积累会使植物出现嫩叶颜色变浅、老叶颜色变黄等表型。乙醇酸由乙醇酸氧化酶氧化成乙醛酸,并伴随有H2O2的产生。乙醛酸最终转化为丝氨酸和CO2;H2O2则被过氧化氢酶分解为H2O和O2。由乙醇酸氧化酶催化的乙醇酸的降解反应是目前已知的植物中代谢乙醇酸的唯一途径。在拟南芥基因组中发现了五个编码乙醇酸氧化酶的基因,分别为GOX1、GOX2、GOX3、HAOX1和HAOX2。五种乙醇酸氧化酶蛋白都被预测定位在过氧化物酶体中。GOX1和GOX2表达的蛋白主要以乙醇酸为底物并参与光呼吸反应,这两个基因在植物的光合组织中高度表达。GOX3在自养组织中的表达量极低,它主要在根系和衰老的叶片中表达,而它在异养器官中的生理功能尚不清楚,研究猜测GOX3的表达蛋白在植物中主要代谢L-乳酸。HAOX1和HAOX2则主要在不同发育阶段的种子中表达,其分别编码的两种酶对中长链的羟基酸具有不同的特性,预测其可能参与脂肪酸和蛋白质的分解代谢。本论文研究的是HAOX1和HAOX2两个基因,目前人们对这两个基因的研究较少,因此对它们在植物体内发挥的功能还不是很了解。通过洋葱表皮细胞的瞬时转化实验证明HAOX1和HAOX2编码的蛋白定位在过氧化物酶体中。实验室前期工作利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了haox1/2双突变体。本论文着重从HAOX1和HAOX2是否是光呼吸途径中的功能基因以及HAOX1和HAOX2蛋白的底物特异性这两个方面展开研究。低CO2环境以及全日照高光条件会促进光呼吸反应的发生。在全日照高光条件下,cat2突变体会因为体内的H2O2大量积累而出现氧化损伤至死亡现象,这种表型称之为光呼吸表型。如果将cat2突变体中产生H2O2的上游途径阻断,那么突变体的光呼吸表型就会被减弱。研究报道cat1/2/3与cat2具有相同的光呼吸表型,由此可以推测将cat1/2/3突变体中产生H2O2的上游途径阻断,那么该突变体的光呼吸表型同样会减弱。本论文探究HAOX1和HAOX2两个基因是否是光呼吸途径中的功能基因主要从以下两个方面进行:（1）将haox1/2突变体与Col-0放置于正常光照培养箱和低CO2光照培养箱中培养,若HAOX1和HAOX2是光呼吸途径中的功能基因,那么haox1/2突变体会因为功能缺失导致体内乙醇酸的积累,出现嫩叶颜色变浅、老叶颜色变黄等表型。实验结果表明低CO2环境下haox1/2与Col-0的生长并无明显不同;（2）通过杂交技术获得cat1/2/3 haox1/2突变体后,将cat1/2/3、haox1/2、cat1/2/3 haox1/2三种突变体与Col-0在长日照培养箱培养10-15天后,转移至全日照高光培养箱中培养一周后观察表型。我们发现突变体cat1/2/3与cat1/2/3 haox1/2生长表型一致,几乎全部死亡;haox1/2与Col-0生长情况一致,无死亡现象,这说明将突变体cat1/2/3中的HAOX1和HAOX2基因敲除,并不能减轻其光呼吸表型。通过以上两个实验我们得出:HAOX1、HAOX2不是光呼吸途径中的功能基因。HAOX1和HAOX2对中长链的羟基脂肪酸底物具有不同的特异性。本论文选择了乙醇酸、2-羟基-4-甲基戊酸、2-羟基辛酸和2-羟基己酸四种底物,进行了底物耐受性实验。我们发现底物为乙醇酸、2-羟基-4-甲基戊酸、2-羟基己酸和2-羟基辛酸时,突变体haox1/2和Col-0的生长都受到了胁迫,如根长变短,叶片发白,但是二者之间并无明显差异。研究报道GOX3与HAOX1、HAOX2具有相似的底物特异性,因此本论文进一步验证了突变体haox1/2和Col-0在底物特异性实验中生长无明显差异的原因是否由GOX3基因导致。我们利用基因编辑技术获得了gox3 haox1/2突变体,并用突变体材料进行了底物特异性实验,发现底物为乙醇酸、leucic、2-羟基己酸和2-羟基辛酸时,突变体gox3 haox1/2和Col-0的生长都受到了胁迫,但是二者也无明显差异。这说明即使GOX3与HAOX1和HAOX2对上述底物都具有特异性,但是其表达基因可能并不是参与上述底物代谢的关键基因。所以尽管将这三个基因同时敲除,突变体与野生型之间的生长表型仍无明显差异。