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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发肝癌病例约56万，我国占1/2以上。原发性肝癌的治疗仍以手术切除为首选，但接受根治性手术的肝癌患者5年生存率仅为30%～40%，而在不可切除的病例中，化疗、放疗和介入治疗的副作用大。近年来，随着分子生物学理论及技术的不断发展，基因治疗已成为肝癌治疗相关的研究热点。但是，目前所进行的肝癌的基因治疗研究大多处于探索性的实验阶段，其中治疗基因在靶细胞、组织及器官中的特异性表达，基因治疗载体的安全性等问题成为限制其进一步临床应用的主要制约因素。生存素（Survivin）是凋亡抑制蛋白（inhibitor ofapoptosis proteins，IAP）家族的成员之一，选择性高表达于常见的恶性肿瘤，如肝细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌等，而在正常组织和成人分化组织中不表达或表达量极低，生存素的选择性表达特征可用于解决治疗基因在恶性肿瘤中靶向表达。因此，利用肿瘤特异性的生存素作为启动子调控治疗基因在肿瘤细胞中表达有望成为肿瘤靶向基因治疗的重要手段。目前，用于肿瘤基因治疗研究的靶基因多数属于凋亡或增殖抑制相关的细胞蛋白，如p53、E1A、BAX和Bik等。近年来的研究发现，许多细胞毒基因如抗菌肽、免疫毒素等具有杀伤肿瘤、抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用，因此具有作为靶基因的潜力。BuforinⅡ是一种具有抗肿瘤作用的抗菌肽，氨基酸序列为TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK。既往研究发现，Buforin Ⅱ对60种肿瘤细胞均有良好的杀伤效果。因此，本课题拟构建Survivin启动子调控的以Buforin Ⅱ作为治疗基因的真核表达载体pSUR-Buforin2，从细胞水平上初步观察其对肝癌细胞凋亡和增殖的影响，为进一步在动物模型中验证其抗肝癌效果奠定基础。目的构建生存素（Survivin）启动子调控下的以Buforin Ⅱ作为治疗基因的真核表达载体，并初步观察其体外抗肝癌效果。方法1.用RT-PCR法和基因克隆技术构建生存素（Survivin）启动子调控的真核表达质粒pSUR-Luc及Survivin启动子调控的、以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的真核表达质粒pSUR-GFP，采用限制性内切酶酶切分析及DNA测序进行鉴定。2.将重组质粒pSUR-GFP用X-tremeGENE介导的转染方法转染人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L02，分别通过流式细胞术检测和荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，验证Survivin启动子在肝癌细胞内特异性启动绿色荧光蛋白表达的能力。3.根据Buforin Ⅱ的氨基酸序列，选用哺乳动物细胞表达偏爱的密码子，合成Buforin Ⅱ基因片段并将其亚克隆到pSUR-Luc载体中，构建pSUR-Buforin2真核表达质粒，采用限制性内切酶酶切分析及DNA测序进行鉴定。4.分别用不含Buforin Ⅱ的质粒pSUR-Luc转染以及未转染的细胞作为阴性和空白对照，将pSUR-Luc、pSUR-Buforin2分别转染人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L02，采用RT-PCR方法检测治疗基因Buforin Ⅱ在HepG2和L02细胞中的表达。5.将pSUR-Luc、pSUR-Buforin2分别转染人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L02，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT比色法）检测其对肝癌细胞的增殖抑制效应。6.分别用不含Buforin Ⅱ的质粒pSUR-Luc转染以及未转染的细胞作为阴性和空白对照，将pSUR-Luc、pSUR-Buforin2分别转染人肝癌细胞HepG2，采用流式细胞术、DNA片段化分析、免疫印迹法（Western Blotting）等检测转染后HepG2细胞的凋亡情况。结果1.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实，pSUR-GFP真核表达质粒构建成功。重组质粒pSUR-GFP转染HepG2细胞和L02细胞48小时后，荧光显微镜下观察显示，仅在转染重组质粒pSUR-GFP的HepG2细胞中观察到绿色荧光，而重组质粒pSUR-GFP转染的L02细胞无绿色荧光蛋白表达，流式细胞术检测进一步证实，pSUR-GFP转染后，约40.9%的HepG2细胞表达绿色荧光蛋白。2.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pSUR-Buforin2真核表达质粒构建成功，RT-PCR结果证实pSUR-Buforin2转染HepG2细胞后，能启动Buforin Ⅱ的表达，而L02细胞未见Buforin Ⅱ表达。3.经MTT实验结果证实，重组pSUR-Buforin2质粒瞬时转染能明显抑制人肝癌细胞HepG2增殖，正常肝细胞L02的增殖未见明显抑制。4.转染pSUR-Buforin2后，流式细胞术检测发现转染pSUR-Buforin2的HepG2细胞凋亡率显著增加；DNA片段化分析出现凋亡特有的基因组DNA片段化（DNA Ladder）；同时，Western Blotting显示，转染pSUR-Buforin2的HepG2细胞中PCNA、Caspase-3蛋白水平明显下降，剪切Caspase-3增加，表明Caspase发生级联激活。结论1.本研究成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的、含生存素启动子的真核表达载体pSUR-GFP，瞬时转染证实生存素启动子能够在肝癌细胞中特异性启动绿色荧光蛋白的表达，表明生存素启动子具有肿瘤特异性，适宜用于构建肝癌基因治疗载体。2.本研究成功构建了肿瘤特异性生存素启动子调控的pSUR-Buforin2真核表达质粒，生存素启动子能够特异性的启动治疗基因Buforin Ⅱ在肝癌细胞中的表达并杀伤肿瘤细胞。pSUR-Buforin2瞬时转染人肝癌HepG2细胞可抑制细胞增殖，其作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡相关。