番茄VKOR基因的克隆、生物信息学分析及功能初步研究

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维生素K环氧化物还原酶(Vitamin K epoxide reductase,VKOR),是一种广泛存在于高等动物内质网上的整合膜蛋白。该基因的同源物在植物中普遍存在,拟南芥VKOR缺失突变体研究表明,该基因对植物的生长具有非常重要的作用,但有关其它高等植物VKOR的研究尚未见报道。本研究以番茄作为材料,利用RACE技术克隆了番茄VKOR基因,并在GenBank上注册(JF951971),命名为LeVKOR。我们对其进行了一系列的生物信息学预测,并对其他植物的VKOR的同源物,进行了生物信息学分析。此外,还利用原核表达和植物转基因的技术对该基因的功能进行了初步研究。具体结果如下:(1)用RACE技术克隆了番茄VKOR基因的全长。从NCBI上通过BLAST,查到1个注册的番茄VKOR的cDNA序列,设计上下游引物,扩增该序列,扩增得到的基因片段与数据库公布的序列不完全相符,在3′末端缺失终止密码子。我们利用RACE技术克隆了该基因的3′端,得到基因全长的cDNA序列,通过序列比对发现该基因定位在番茄的2号染色体上,该基因(LeVKOR)由7段外显子组成,其开放阅读框架包括1122bp,共编码373个氨基酸残基。LeVKOR共有10个半胱氨酸残基,其8个是保守的半胱氨酸,而保守的半胱氨酸中有四个半胱氨酸以CXXC基序的形式存在。(2)利用在线软件预测LeVKOR的信号肽及高级结构。利用多种软件预测了该基因产物的亚细胞定位,该基因定位于叶绿体上,其N端有一段包括47个氨基酸残基的信号肽。高级结构预测结果显示,LeVKOR基因,是一个融合蛋白,有两个结构域组成,包括一个跨膜结构域和一个可溶性结构域。对在NCBI上已注册的12种植物VKOR基因进行氨基酸序列比对和进化树分析,表明植物来源的VKOR蛋白的N端都有一段信号肽,大部分定位在叶绿体上,均由两段结构域组成。(3)亚细胞器定位表明LeVKOR蛋白定位于叶绿体类囊体膜。对叶绿体亚细胞器组分进行分离,以类囊体膜蛋白D1检验叶绿体组分的可靠性,用AtVKOR的抗体和D1的抗体,做Western-blot检测,结果证明LeVKOR蛋白定位于叶绿体类囊体膜,通过分子建模比对,其可溶性结构域面向类囊体腔。(4)缺失信号肽的LeVKOR具有催化二硫键形成的功能。构建原核表达系统对该基因的功能进行了初步研究,把去掉信号肽的LeVKOR全长基因连接到pTrc99a质粒上,利用二硫键形成缺陷型大肠杆菌菌株研究其功能,运动性和半乳糖苷酶实验结果都显示,该基因具有催化二硫键形成的功能。(5)构建正义、反义和干涉的植物表达载体,获得转基因植株。利用pBI121和pFGC1008质粒,构建了LeVKOR正义、反义和干涉的表达载体,转化农杆菌,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化番茄,获得了转基因植株,现已获得T1代转基因苗,通过LeVKOR基因在转基因番茄里过表达或抑制表达,研究该基因的功能,初步确定该基因具有抗氧化的功能。
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