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研究背景和目的:肝细胞癌（HCC）是世界上最常见、恶性程度较高的人类恶性肿瘤之一,国际癌症研究机构报告显示每年约有80万例新发病例和70万例死亡病例[1-2]。肿瘤增殖是一个复杂的过程,许多细胞的内在特性和外部微环境因素影响肝癌细胞的增殖能力[3]。然而,介导肝癌增殖的潜在分子机制在很大程度上仍不清楚。GRP78是未折叠蛋白质反应（UPR）的重要调控蛋白,在应激条件下细胞的适应和存活中起着至关重要的作用[4]。许多研究证明GRP78在多种肿瘤中高表达,并有作为生物标志物和治疗靶点的潜力[5-6]。我们的前期研究也发现GRP78在肝癌组织中呈高表达,且GRP78的高表达与肝癌的发生发展密切相关[7-8]。以上研究表明GRP78可以影响肿瘤的发生发展过程,GRP78可能成为一个潜在的调节肿瘤增殖的靶点。TGF-β信号通路被证实在生长发育和肿瘤发生发展过程中具有十分重要和广泛的作用[9-10]。越来越多的研究发现TGF-β信号通路在肝癌形成后促进癌细胞的存活与增殖[11-13]。受体活化的Smad锚定蛋白（SARA）被认为是调控TGF-β信号通路的关键蛋白,相关研究表明SARA可直接与Smad2/3和TGF-β受体复合物相互作用,直接磷酸化作用激活Smad2/3[14-15]。磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4形成三聚体,然后,三聚体易位到细胞核中,与转录因子结合以调节基因转录从而促进肿瘤的发展[16-17]。但是目前SARA的调控方式以及在肝癌中的作用尚不清楚,GRP78是否通过调节SARA影响TGF-β信号通路需要进一步探索。方法:1.构建稳定干扰GRP78的HCCLM3细胞,收集shGRP78-HCCLM3细胞与NC-HCCLM3进行RNA测序,利用生物信息学分析差异表达基因来探索在肝癌细胞中与GRP78相关的生物学过程和分子功能。2.进一步分析TCGA、ICGC数据库中肝癌患者的GRP78和SARA的表达水平,分析其表达的相关性,并探索其临床意义。3.探索不同肝癌细胞系中GRP78和SARA的mRNA和蛋白表达的表达水平,选取GRP78表达较高和表达较低的肝癌细胞系各一株,进一步在GRP78高表达的细胞中沉默GRP78的表达,在GRP78低表达的细胞中过表达GRP78,检测GRP78与SARA的mRNA和蛋白的变化情况,通过CCK8和EdU实验观察肝癌细胞的增殖能力的变化。4.运用回复实验检测GRP78和SARA的上下游关系。在高表达GRP78的肝癌细胞中沉默GRP78同时增加SARA的表达,在低表达GRP78的肝癌细胞中过表达GRP78同时干扰SARA的表达,观察GRP78和SARA的mRNA和蛋白的变化,同时利用EdU实验观察肝癌细胞增殖能力的变化。同时观察在干扰或过表达GRP78后Smad2/3、P-Smad2/3蛋白变化情况。结果:1.通过对收集shGRP78-HCCLM3与NC-HCCLM3进行RNA测序发现,干扰GRP78表达后174个基因显著上调,133个基因显著下调。通过Metascape分析发现TGF-β信号通路和细胞对生长因子刺激的反应等生物学过程和分子功能相关受到显著影响,并且IPA分析也发现干扰GRP78表达后TGF-β信号通路受到明显抑制,进一步分析发现TGF-β信号通路的关键蛋白SARA的表达水平在干扰GRP78后显著下降。2.综合测序结果以及对公共数据库TCGA和ICGC中肝癌患者的转录组学数据分析发现GRP78与SARA在肝癌组织中表达量均显著上升,TCGA数据库中GRP78与SARA的相关性系数为0.35,P-Value=9.6x10-14,ICGC数据库中GRP78与SARA的相关性系数为0.38,P-Value=2.2x10-16,TCGA数据库中肝癌患者的GRP78、SARA表达水平与患者的预后之间的相关性发现GRP78的表达水平与肝癌患者更短的总体生存期呈正相关,SARA的表达水平与肝癌患者更短的总体生存期和无进展间隔呈显著正相关。3.细胞筛选结果发现HCCLM3中的GRP78和SARA的表达较高,SMMC7721中的GRP78和SARA的表达较低。Western印迹和q RT-PCR实验表明,GRP78的沉默可以降低HCCLM3细胞中SARA的表达,而过表达GRP78可以增加SMMC7721细胞中SARA的表达（P<0.01）。细胞免疫荧光实验也是同样的结果。4.CCK8实验、EdU增殖实验结果显示:与NC组相比沉默GRP78会抑制了肝癌细胞的增殖,而GRP78的过表达增强了肝癌细胞的增殖能力。而且干扰SARA的表达可以抑制肝癌细胞的增殖,而SARA的过表达增强了肝癌细胞的增殖能力。5.Recovery实验结果显示干扰GRP78后SARA的表达水平也会下降,并且肝癌细胞的增殖能力降低。然而,干扰GRP78的同时过表达SARA可以回复干扰GRP78造成的肝癌增殖能力下降。过表达GRP78后SARA的表达随之上升,并且肝癌细胞的增殖能力增强。然而,过表达GRP78的同时干扰SARA的表达可以降低过表达GRP78造成的肝癌增殖能力的上升。并且干扰GRP78后Smad2/3的蛋白水平不变、P-Smad2/3的蛋白水平下降。与之相反,过表达GRP78后Smad2/3的蛋白水平依然不变、P-Smad2/3的蛋白水平随之上升。结论:在肝细胞癌中GRP78可以影响TGF-β信号通路的激活,通过实验发现GRP78可能通过上调SARA促进Smad2/3的磷酸化激活TGF-β信号通路促进肝细胞癌增殖。