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研究背景与目的:胰岛β细胞感应循环血中营养物质变化,分泌机体中唯一降血糖的激素—胰岛素。胰岛素的绝对或相对不足是导致糖尿病发生的基础。细胞分裂周期调控蛋白42（Cdc42）是属于Rho家族的小分子GTP酶。研究表明,Cdc42在葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程中发挥作用,尤其对GSISⅡ相分泌至关重要。作为三大营养物质之一的氨基酸,在机体调节胰岛素分泌过程中起着类似于葡萄糖的作用,是调控胰岛素合成分泌的生理性刺激因子。越来越多的研究表明谷氨酰胺（GLN）/谷氨酸（GLU）及其下游代谢产物对胰岛素分泌以及糖尿病的发生发展起着不可忽视的作用。2型糖尿病（T2D）患者血浆谷氨酰胺水平降低,补充谷氨酰胺可改善病人血糖控制。谷氨酰胺酶（GLS1）作为谷氨酰胺代谢过程的第一个关键酶,其将谷氨酰胺代谢为谷氨酸进入三羧酸循环为细胞提供能量,为大分子的合成提供底物。近年来的研究显示,Cdc42可增强肿瘤细胞谷氨酰胺酶活性。Cdc42是否通过调节谷氨酰胺代谢来影响胰岛β细胞相关生理功能（例如,代谢状态、能量供应、胰岛素的合成和分泌）还未见报道。本课题旨在利用胰岛β细胞特异性敲除Cdc42小鼠模型和胰岛β细胞系,阐明Cdc42对胰岛β细胞中谷氨酰胺/谷氨酸代谢及其作用发挥的调节作用和机制。方法:1.利用Cdc42 LoxP小鼠与胰岛β细胞特异性表达Cre（RIP）小鼠交配,得到胰岛β细胞特异性敲除Cdc42小鼠,PCR鉴定小鼠DNA中是否插入RIPCre基因,Cdc42两端是否插入Flox序列;Cdc42F/F（+）为胰岛β细胞特异性敲除Cdc42小鼠,以KO表示,Cdc42 F/F（-）为对照组小鼠,以WT表示。分离小鼠胰岛进行Western blot/qRT-PCR分析小鼠胰岛β细胞中Cdc42表达量程度;2.采用代谢笼检测KO/WT小鼠在正常饮水/20%葡萄糖水喂养后小鼠饮食饮水和其他代谢参数的变化情况;3.饥饿处理16h后,分别腹腔注射20%葡萄糖溶液+PBS（5min）/20%葡萄糖+7.5%谷氨酰胺溶液（5min）,测定和比较小鼠血糖变化情况;4.分离纯化小鼠胰岛以及制备抑制Cdc42活性或抑制谷氨酰胺酶（GLS1）活性的小鼠胰岛β细胞系Min6或人胰岛β细胞系1.1B4细胞模型,采用胰岛素Elisa试剂盒检测β细胞在谷氨酰胺存在条件下,低糖、高糖刺激后胰岛素的分泌情况;5.Western blot/RT-qPCR检测并比较小鼠胰岛或Min6细胞在缺失或抑制Cdc42后,谷氨酰胺代谢通路相关基因（GLS1/GDH/SLC1A5）的表达水平;6.采用Cdc42特异性抑制剂ML141、谷氨酰胺酶特异性抑制剂968或siRNA抑制谷氨酰胺酶表达后,检测Min6或1.1B4细胞的细胞活性,细胞内ATP和谷氨酸含量以及细胞外氧气消耗速率（OCR）;7.蛋白免疫印迹法检测经药物处理后胰岛β细胞内AMPK蛋白磷酸化变化情况。结果:1.基因型鉴定结果显示,KO小鼠基因组DNA中含有RIPCre基因序列,Cdc42基因两端插入了Flox序列;提取小鼠胰岛进行Western blot/RT-qPCR,结果显示胰岛β细胞特异性敲除Cdc42小鼠,其胰岛中的Cdc42蛋白表达和mRNA水平显著下调,胰岛β细胞条件性敲除Cdc42小鼠构建成功。2.代谢笼结果显示,正常喂养条件下KO组较WT组小鼠饮水量增大,但摄食量、二氧化碳产生量（VCO2）、氧气消耗量（VO2）无明显变化;加喂20%葡萄糖水后,KO组小鼠较WT组小鼠饮水量显著增大,摄食量减少,二氧化碳产生量（VCO2）显著性增大、夜间氧气消耗量（VO2）显著性增大;同时,加喂20%葡萄糖水后,KO组小鼠血糖明显升高。3.腹腔注射20%葡萄糖溶液+PBS（5min）或20%葡萄糖+7.5%谷氨酰胺溶液（5min）,WT小鼠血糖15min达到高峰,KO小鼠血糖达到高峰时间推迟。在注射葡萄糖30min后,KO小鼠血糖较WT组高,且具有显著性差异,KO小鼠葡萄糖耐量明显受损,WT组中20%葡萄糖+7.5%谷氨酰胺（5min）小鼠血糖明显低于20%葡萄糖溶液组,谷氨酰胺可缓解WT小鼠的血糖上升,然而,谷氨酰胺这一降糖作用在KO小鼠中受到抑制。4.谷氨酰胺可促进胰岛β细胞系Min6细胞胰岛素分泌。谷氨酰胺对基础葡萄糖浓度下胰岛的胰岛素分泌有一定的增强作用;同时显著促进高糖条件下胰岛素的分泌,这一作用在β细胞缺失Cdc42时明显受到抑制。5.敲除Cdc42或采用ML141抑制Cdc42活性后,小鼠胰岛β细胞中GLS1蛋白和mRNA水平显著下调,显著降低谷氨酰胺诱导的细胞外氧消耗、细胞活性和ATP含量;但对谷氨酸脱氢酶（GDH）和谷氨酰胺转运蛋白（SLC1A5）mRNA水平无显著性影响。6.谷氨酰胺显著增加β细胞细胞外氧消耗,细胞活性,细胞内谷氨含量。采用siRNA或谷氨酰胺酶特异性抑制剂968后,GLS1的表达和活性、细胞活性,胞内ATP含量,胞内谷氨酸含量等均显著降低。7.谷氨酰胺对AMPK磷酸化具有抑制作用;使用ML141抑制Min6细胞Cdc42活性或使用968抑制谷氨酰胺酶活性,均可增强基础葡萄糖/谷氨酰胺协同作用时AMPK磷酸化,同时AMPK磷酸化随着Cdc42抑制剂ML141使用浓度加大而增强;但并不影响LKB1磷酸化。结论:胰岛β细胞特异性缺失Cdc42抑制胰岛素的分泌,影响机体对葡萄糖的耐受性,但对外周组织胰岛素的利用没有明显影响。谷氨酰胺可降低葡萄糖引起的血糖升高,对胰岛素分泌具有促进作用,但其降血糖和促进胰岛素分泌作用在Cdc42缺失时受到抑制。谷氨酰胺可提高细胞内谷氨酸水平,ATP含量,增强细胞活性和代谢能力。Cdc42对谷氨酰胺代谢过程中的关键酶谷氨酰胺酶（GLS1）表达具有调节作用。而且抑制β细胞Cdc42或GLS1后细胞内谷氨酸水平、ATP含量、细胞活性、细胞代谢能力均同步性下降。表明Cdc42可能通过调节谷氨酰胺酶的表达影响细胞内谷氨酰胺代谢,进而对胰岛β细胞生理功能产生影响。