PRRSV与Wnt/β-catenin信号通路互作机制的初步研究

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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)感染引起的一种猪的急性传染病,主要造成母猪严重的繁殖障碍以及仔猪和成年猪的呼吸系统疾病,以其高的发病率、感染率著称,这已经给全世界的养猪企业造成了巨大的损失。繁殖与呼吸综合征病毒是一种折叠的、单股正链RNA病毒,动脉炎病毒科动脉炎病毒属。PRRS主要是通过疫苗进行防控,但是由于PRRSV变异速度快,致病机制复杂,所以使用单一疫苗并不能有效的防控,因此,对于PRRSV的致病机制还需要我们更深入的研究。Wnt/β-catenin信号通路不但在肿瘤形成、器官发育、细胞增殖与迁移方面发挥着重要的作用,而且在病毒的复制和天然免疫中同样发挥着重要的作用。研究显示,Wnt/β-catenin信号通路的激活能够抑制甲型流感病毒的复制,但是却促进裂谷热病毒的复制,对仙台病毒和猪类圆环病毒的复制也发挥着重要的作用。然而,Wnt/β-catenin信号通路与PRRSV相互作用的调控机制目前尚不清楚。本研究旨在解释Wnt/β-catenin信号通路与PRRSV互作机制,为探究Wnt/β-catenin信号通路参与PRRSV致病机制及靶向该通路活性进行抗PRRSV研究提供科学依据。为研究PRRSV感染对Wnt/β-catenin信号通路的作用,我们使用PRRSV感染MARC-145或PAM细胞,应用q RT-PCR检测Wnt/β-catenin通路目的基因的表达。应用Western blot技术检测MRAC-145细胞内β-catenin蛋白的变化。应用双荧光素酶技术检测Wnt/β-catenin信号通路的活性。应用间接免疫荧光技术检测β-catenin蛋白在细胞核和细胞质中的变化。应用双荧光素酶技术检测PRRSV的结构或非结构蛋白激活Wnt/β-catenin通路的能力。结果表明:(1)PRRSV感染MARC-145细胞6 h后c-myc、cyclin D1转录水平明显升高,axin2的转录水平明显降低,而感染PAM细胞12 h后,c-myc和cyclin D1显著升高。(2)β-catenin的总蛋白表达并没有产生显著的变化,但是在Ser33/37/Thr41位的磷酸化的β-catenin蛋白表达从12 h开始逐渐下调,而在Ser552位的磷酸化β-catenin蛋白表达在12 h开始上调。(3)Wnt/β-catenin信号通路的活性升高。(4)β-catenin在细胞核内积聚增加。(5)PRRSV通过Nsp1α、Nsp1β、Nsp3、Nsp4、Nsp7、Nsp10、Nsp12、ORF2b、ORF3和ORF5均能够激活Wnt/β-catenin通路活性。为阐明Wnt/β-catenin信号通路在PRRSV复制过程中起到的作用,我们使用Wnt3a激活Wnt/β-catenin信号通路,结果表明Wnt3a抑制PRRSV的复制并具有剂量依赖性。同时,我们应用过量表达和沉默表达β-catenin的方法证明激活Wnt/β-catenin信号通路抑制PRRSV的复制,而抑制Wnt/β-catenin信号通路增加PRRSV的复制。为进一步揭示Wnt/β-catenin通路通过什么途径抑制PRRSV的复制,我们应用过量表达和沉默表达β-catenin的方法检测免疫及炎症因子的变化、磷酸化的IRF-3和NF-κb蛋白表达的变化及IFIT1和NF-κB启动子活性的变化。结果表明:(1)过量表达β-catenin之后DDX58、IFN-β、IFIT1的m RNA的转录水平显著升高,炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达水平显著升高。沉默表达β-catenin后,DDX58、IFN-β和IFIT1的m RNA的转录水平显著降低,炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达水平也显著降低。(2)过量表达β-catenin可以增加磷酸化的IRF-3和NF-κb的蛋白水平而沉默表达β-catenin抑制磷酸化的IRF-3和NF-κb的蛋白水平。(3)过量表达β-catenin增加NF-κB和IFIT1启动子的活性而沉默表达β-catenin抑制NF-κB和IFIT1启动子的活性。(4)PRRSV感染MARC-145诱导β-catenin与NF-κB的相互作用。综上所述,PRRSV通过其Nsp1α、Nsp1β、Nsp3、Nsp4、Nsp7、Nsp10、Nsp12、ORF2b、ORF3和ORF5激活Wnt/β-catenin信号通路。活化的Wnt/β-catenin信号通路通过介导NF-κb依赖性的固有免疫应答抑制PRRSV的复制。
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