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产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起初生和断奶仔猪腹泻的重要病原体,在全世界范围内造成养猪业的巨大经济损失。通常认为ETEC通过黏附素定殖于仔猪肠上皮细胞,大量繁殖后通过释放肠毒素损伤肠道屏障并引起仔猪腹泻。大肠杆菌无法自身合成AHLs,却编码LuxR同源蛋白SdiA,可感应并应答于其他细菌产生的各种群体信号,通过这种被称为“群体感应窃听”的行为调控自身群体感应相关基因;即可窃听环境中优势菌种的联络信号,在自身种群未达到致病规模时提前诱导相应基因表达,以获得生存或致病优势。在前期研究中,我们发现Ⅰ型群体感应信号分子AHL能够直接诱导肠上皮细胞凋亡,造成肠上皮细胞骨架损伤,破坏肠道粘膜机械屏障,可协助病原菌发挥致病作用,细菌移位并进入体循环造成全身感染。aiiA基因编码的AiiA蛋白通过水解AHLs分子的内酯环,使AHLs分子失去生物活性,降低了 AHLs分子的浓度,进而减弱病原菌致病基因的表达。本研究旨在探究AiiA对AHL调控下猪源F4ac+产毒素大肠杆菌致肠道微生物屏障、机械屏障、免疫屏障损伤的保护作用,进一步明确群体感应抑制剂作用机制和应用前景。具体研究内容如下:1.群体感应AHL信号对猪源F4ac+产肠毒素大肠杆菌生物学特性的影响。将负责合成侧链长链AHL分子（3OC12-HSL）的铜绿假单胞菌lasI基因,和负责合成侧链短链AHL（C6-HSL）的小肠结肠炎耶尔森菌yenI基因,分别转化至ETEC菌株C83902中,赋予其内源合成3OC12-HSL和C6-HSL信号分子的能力;同时分别在培养基中外源添加200 μmol/L的3OC12-HSL、C6-HSL,与ETEC菌株C83902共同培养。通过不同来源（外源、内源添加）不同种类（长链、短链侧链）AHL分子,分别刺激ETEC菌株,观测其生长特性、生物被膜形成能力、对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2粘附能力等生物学特性变化;运用Real-time PCR技术,检测AHL影响下菌毛、鞭毛、肠毒素、黏附素、溶血素等主要毒力因子转录水平。结果表明群体感应AHL影响下ETEC菌株生物被膜形成能力显著降低,对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2的粘附能力显著降低,鞭毛fliC等主要毒力因子基因表达受调控。2.ETEC介导AHL对宿主肠道屏障的影响。通过体外不同培养条件下对ETEC生长速率的测定,并利用荧光定量PCR对ETEC生长、应激相关基因进行定量。发现静置培养时AHL对ETEC生长速率有显著促进作用,ETEC应激反应相关基因rpoS、rmf、促分裂生长基因ftsZ表达水平显著升高。通过建立体外模拟肠道菌群模型,并对其中大肠杆菌的生长特性进行定量分析。结果显示体外环境AHL作用下,C83902在6h、12 h、18 h、24 h,生长数量分别提高了 20.5%,37.6%,27.5%,33.9%。通过在饮用水中添加AHL,进行小鼠肠道菌群16s组学试验。组学结果显示,AHL作用下小鼠肠道菌群物种组成及相对丰度发生显著变化;差异物种Heatmap图、种属水平Top10菌种分析均显示大肠杆菌在AHL作用下数量下调。通过荧光定量PCR方法对小鼠肠道菌群中大肠杆菌数量进行定量,结果与小鼠肠道菌群16s组学一致,即体内环境中AHL抑制大肠杆菌生长。将野生株ETEC C83902与ETEC鞭毛缺失株C83902ΔfliC同时刺激猪小肠上皮细胞IPEC-J2,可见缺失株诱导肠上皮细胞凋亡能力下调7.6%。在缺失株组添加鞭毛素FliC蛋白,诱导凋亡能力回复。利用AHL与ETEC共同刺激猪小肠上皮细胞IPEC-J2以建立细胞模型;同时建立群体感应信号分子AHL与致病性大肠杆菌ETEC共同感染的小鼠模型,通过ELISA方法分别检测猪肠上皮细胞上清和小鼠血清中免疫因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β水平的表达情况。相较于阴性对照组,3OC12-HSL组可直接诱导肠上皮细胞及小鼠产生免疫应答,各免疫因子的表达显著升高,表明群体感应信号分子AHL可影响干扰肠道免疫屏障;在猪肠上皮细胞IPEC-J2上,相较于C83902组,C83902+3OC12-HSL组IL-1β、IL-6的产生水平分别下降了 9.7%、3.5%,IL-10、TGF-β的产生水平分别上升了 4.5%、16.7%。在小鼠血清中,相较于C83902组,C83902+3OC12-HSL组IL-6、TNF-α的产生水平分别下降了 8.1%、5.7%,IL-1β的产生水平上升了12.6%。以上结果显示ETEC介导下,AHL信号在肠道环境中严重干扰肠道微生物屏障,同时对机械屏障、免疫屏障也有一定程度的影响。3.AiiA对AHL/ETEC影响肠道屏障的保护作用。通过在不同试验体系中加入群体感应抑制剂AiiA,展示了群体感应抑制剂QSI对AHL/ETEC影响肠道屏障的保护作用。静置培养试验显示AiiA抑制了体外试验中AHL对ETEC的生长刺激;小鼠肠道菌群16s组学试验展示了 AiiA组与对照组结果相近,即体内试验中AHL展现了对体内大肠杆菌的生长抑制,而AiiA可有效消除这种抑制作用,维护肠道菌群的平衡,从而保护肠道微生物屏障。小鼠血清及仔猪肠上皮细胞IPEC-J2细胞上清相关ELISA试验结果均显示AiiA可抑制AHL刺激下宿主肠道IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、IL-1β的免疫应答,保护肠道免疫屏障。建立群体感应信号分子AHL与致病性大肠杆菌ETEC共感染小鼠模型,饲喂含有QSI的饲料,利用DAO、D-乳酸、LPS、HE染色、TUNEL染色检测肠道屏障完整性。结果显示AHL能够刺激小鼠小肠肠绒毛皱缩,排列稀疏,长度缩短,肠道细胞凋亡;而QSI保护下小肠绒毛受影响较少,细胞凋亡率下调。肠道屏障指标ELISA结果显示C83902+3OC12-HSL+AiiA组中DAO、D-乳酸、LPS的含量显著低于C83902组和C83902+3OC12-HSL组。以上结果表明,QSI对ETEC介导的AHL致肠道屏障损伤存在一定保护作用。