脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种中枢神经系统损伤,可导致严重的运动、感觉和自主功能障碍。由于受损的神经元难以再生和修复,尚无有效治疗脊髓损伤的方法。随着科学技术及临床医学的发展,细胞移植成为促进脊髓损伤修复的潜在方法。移植后的细胞能够通过多种机制发挥功效,包括神经保护、免疫调节、促进轴突萌发和/或再生以及促进髓鞘再生等。然而,受到损伤部位恶劣微环境的影响,移植细胞的存活及功能的发挥成为临床治疗脊髓损伤的亟待解决的难题。支架和细胞是组织工程的两大构成要素。近年来,生物材料被广泛应用于神经系统损伤修复,以改善微环境,促进移植细胞的存活。因此,为移植细胞提供结构和功能支持的生物支架有利于神经损伤的有效修复。有研究表明,丝素蛋白纤维移植到损伤部位可改善受损微环境,促进神经纤维再生,而不引起炎症反应,是神经再生医学组织工程的理想选择。本实验室前期研究表明,丝素蛋白纤维对神经类细胞具有良好的生物相容性,为细胞提供丰富的粘附位点。将其设计成更接近体内环境的多孔三维结构有助于神经细胞迁移、增殖、分化以及损伤部位的神经纤维再生。本实验中使用的三维丝纤维(three-dimensional silk fibrous,3D-SF)存在大量纤维多孔结构,具有更大的比表面积。皮肤成纤维细胞具有取材方便、来源广泛、体外扩增能力强、便于自体移植等优点,已成为优良的重编程种子细胞。我们通过组织块培养法获得大鼠皮肤成纤维细胞(rat dermal fibroblasts,RDFs),经传代纯化后进行细胞免疫荧光染色,鉴定结果显示细胞均呈S100A4和Vimentin阳性。将RDFs接种于3D-SF支架,通过对细胞骨架F-actin和Hoechst 33258的荧光染色发现RDFs沿着支架纤维的方向生长,具有纺锤形立体形态;通过CCK-8实验检测细胞增殖表明3D-SF为RDFs提供更多的粘附位点和增殖空间,培养7 d内细胞数量持续增加;使用流式细胞术检测3D-SF支架对RDFs的细胞毒性,与培养在PDL包被基质的细胞相比,生长在3D-SF上的细胞存活比率没有显著性差异,表明3D-SF不引起细胞凋亡。综上所述,3D-SF具有良好的生物相容性,是细胞移植支架的良好选择。目前,用于移植修复中枢神经系统损伤的细胞主要是具有神经元分化潜能的干细胞,然而,移植到损伤处的干细胞大部分分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞,而不是功能性神经元,导致治疗效果不佳。近年来的研究表明,通过外源转录因子导入、小分子化合物诱导、miRNAs转导等多种方法将体细胞直接重编程为神经元,不失为一种大量获得移植治疗中枢神经系统损伤的功能性细胞的新方法。其中,小分子化合物诱导的重编程凭借分化效率高、诱导周期短、避免外源基因插入的风险等优势成为当前的研究热点。它们的生物学效应可以通过不同浓度和不同组合来精确控制,而且往往是迅速、可逆的。大量研究表明,单纯小分子化合物即可诱导多种体细胞向神经元的转分化。已有研究表明,小分子化合物能将成纤维细胞重编程为神经元,且不同的小分子组合诱导得到不同亚型的神经元。综上,小分子化合物诱导的重编程具有巨大的临床应用潜力。为了筛选高效介导皮肤成纤维细胞转变为神经元的化学方法,我们查阅大量文献,初步确定潜在的候选分子。最终,通过预实验筛选获得了7种小分子化合物作为主要的功能分子,分别是 CHIR99021、Forskolin、LDN193189、SB431542、SP600125、VPA、Y27632,简称为“CFLSSVY”。它们可以调节在神经发育和神经分化中起关键作用的信号通路,或调节组蛋白甲基化及乙酰化修饰以提高重编程效率。RDFs经“CFLSSVY”诱导分化7 d,细胞免疫荧光染色结果显示获得Tubb3阳性的化学诱导神经元(chemically induced neurons,CiNs)。为了探究这7种小分子化合物对重编程是否是必需的,我们在“CFLSSVY”基础上减少小分子分别进行诱导。细胞免疫荧光染色发现,减少不同的小分子组合也能够诱导RDFs重编程为神经元。其中,仅有3种小分子化合物“CFV”(即CHIR99021、Forskolin、VPA)就能启动转分化,表明这3种小分子化合物在诱导RDFs重编程过程中起关键作用,是命运转变所必需的。相比其他组合,“CFLSSVY”诱导的重编程效率最高(Tubb3阳性率达80%),CiNs形态更加典型、立体,最终将其作为诱导RDFs重编程的最佳小分子组合。为了促进神经元的存活与成熟,我们将培养方案进行优化。有研究表明,CHIR99021、Forskolin和SP600125(简称“CFS”)能够促进神经元存活和成熟。于是诱导7d后撤去其他几种小分子,只添加“CFS”培养至14d,获得了大量NeuN阳性的神经元,表明这些细胞已经成熟;随后撤去“CFS”培养至28 d,大部分CiNs呈Synapsin-1阳性,表明已表达突触蛋白,可能是功能性神经元。综上所述,我们筛选并确定了高效诱导RDFs重编程获得成熟CiNs的化学培养方案,为细胞移植治疗脊髓损伤奠定了基础。迄今为止,小分子诱导成纤维细胞转分化为神经元的研究已经有所进展,但其应用于体内神经损伤修复的研究鲜有报道。我们使用3D-SF作为支架,利用已确定的化学诱导方案将支架上的RDFs重编程为CiNs,成功构建组织工程神经网络(3D-SF-CiNs)。通过胸椎T9～T10段切除2 mm的脊髓构建大鼠SCI模型,研究神经网络对SCI的修复作用。术后立即移植神经网络到大鼠脊髓损伤处,持续观察8 w,组织学水平检测发现移植神经网络有效地填补损伤空洞,减少胶原沉积,促进神经纤维再生。通过BBB评分及45°网格攀爬实验检测后肢运动功能,发现移植3D神经网络对大鼠后肢运动功能恢复有显著的促进作用。本研究证实,由3D-SF支架和化学诱导重编程获得的神经元组成的神经网络移植能够显著促进损伤处的神经纤维再生和运动功能恢复,这一研究成果为治疗包括脊髓损伤在内的中枢神经系统损伤提供了新策略。