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背景:骨肉瘤（OS）是临床上儿童和青少年最常见的原发性骨恶性肿瘤,主要发生于管状长骨的干骺端。手术,化疗和放疗是OS的标准治疗方法,尽管近年来治疗方法的改善显著降低了患者的死亡率,但是患者的总体生存期并没有得到显著的延长。因此,亟需寻找新的治疗方法以提高OS患者治疗效果和改善患者生活质量。左旋布比卡因是临床上常用的局麻药,同时被证实能够影响胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的疾病进展。但是,关于左旋布比卡因在OS疾病进程中的功能作用及相关机制尚不明确。因此,本研究拟深入探讨左旋布比卡因对OS疾病进展的影响,以为明确OS发生发展机制和寻找新的治疗靶点奠定理论基础。目的:1、通过使用左旋布比卡因干预OS细胞,观察左旋布比卡因对OS细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等恶性生物学行为的影响;2、探讨左旋布比卡因调控OS细胞恶性生物学行为的具体分子机制。方法:第一部分:为了检测左旋布比卡因对OS细胞恶性生物学行为的影响,本项研究首先用0或2m M的左旋布比卡因处理MG63和U2OS细胞,然后通过Ed U实验和平板克隆形成实验检测MG63和U2OS细胞增殖能力的变化,利用流式细胞术检测MG63和U2OS细胞凋亡水平的变化;通过划痕愈合和Transwell实验检测MG63和U2OS细胞迁移和侵袭能力的变化;此外,本项研究还通过肿瘤球形成实验初步检测了左旋布比卡因对MG63和U2OS细胞干性特征的影响,同时通过Western blot进一步检测了左旋布比卡因对MG63和U2OS细胞干性标志蛋白表达水平的影响。最后,本项研究利用MG63和U2OS细胞构建裸鼠骨肉瘤荷瘤模型,并给以左旋布比卡因干预,观察不同处理组裸鼠的肿瘤生长情况,明确左旋布比卡因对裸鼠体内成瘤能力的影响。第二部分:为了探讨左旋布比卡因影响OS恶性生物学行为的具体分子机制,本项研究首先用0或2m M的左旋布比卡因处理MG63和U2OS细胞,并通过q RT-PCR实验检测MG63和U2OS细胞中MAFB的表达变化;然后通过生物信息学分析寻找MAFB相互作用的分子。为了明确KAT5影响OS疾病进程的分子机制,本项研究通过Ch IP实验检测KAT5与MAFB之间的调控关系,同时通过q RT-PCR实验观察敲低KAT5和过表达KAT5对MG63和U2OS细胞中MAFB表达水平的影响。然后,本项研究通过RNA干扰技术敲低KAT5在MG63和U2OS细胞中的表达,利用Ed U实验检测敲低KAT5对MG63和U2OS细胞增殖能力的影响,采用流式细胞术检测敲低KAT5对MG63和U2OS细胞凋亡水平的影响,利用肿瘤球形成实验检测敲低KAT5对MG63和U2OS细胞干性的影响,通过Western blot实验检测敲低KAT5对MG63和U2OS细胞干性标志蛋白的影响;最后,为了证实左旋布比卡因通过KAT5/MAFB轴在OS疾病进展中发挥作用,本项研究在用左旋布比卡因干预MG63和U2OS细胞的同时过表达KAT5,通过q RT-PCR检测MAFB的表达变化,利用Ed U实验检测MG63和U2OS细胞增殖能力的变化,通过流式细胞术检测MG63和U2OS细胞凋亡水平的变化,采用肿瘤球形成实验和Western blot实验检测MG63和U2OS细胞干性的变化。结果:第一部分:1、Edu实验和平板克隆形成实验的结果发现,左旋布比卡因处理后,MG63和U2OS细胞的染色阳性率显著下降,且克隆集落形成能力明显降低,提示左旋布比卡因能够抑制OS细胞的增殖能力。2、划痕愈合实验发现,左旋布比卡因处理后,MG63和U2OS细胞的划痕愈合能力明显降低;Transwell实验结果表明,左旋布比卡因处理后,MG63和U2OS细胞穿过小室的数量显著降低。这些结果表明左旋布比卡因可以明显抑制MG63和U2OS细胞的迁移和侵袭能力。3、流式细胞术结果发现,左旋布比卡因处理细胞后,MG63和U2OS细胞的早期和晚期凋亡水平均明显提高,表明左旋布比卡因能够显著提高MG63和U2OS细胞的凋亡水平。4、肿瘤成球实验结果发现,左旋布比卡因可以明显下调MG63和U2OS细胞的成球数量和细胞球的体积;Western blot结果显示,左旋布比卡因能够明显抑制细胞干性标志蛋白Sox-2、Oct3/4和Nanog的表达水平。这些结果表明左旋布比卡因可能对OS细胞的干性具有一定的抑制作用。5、体内实验结果发现,左旋布比卡因能够显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤体积、重量及肺转移能力,提示左旋布比卡因可以抑制MG63和U2OS细胞在裸鼠体内的成瘤能力及转移能力。第二部分:1、QRT-PCR实验结果表明,左旋布比卡因可以显著抑制MG63和U2OS细胞中MAFB的表达水平。2、ChIP实验结果显示,KAT5在MAFB启动子上被富集,且当敲低MG633、EdU实验发现,敲低KAT5能够明显抑制MG63和U2OS细胞的增殖能力;流式细胞术结果显示,敲低KAT5能够显著提高MG63和U2OS细胞的凋亡水平和U2OS细胞中KAT5后,细胞中MAFB富集下调,且H3K27ac和RNA聚合酶II在MAFB启动子区的富集水平显著下调。。4、肿瘤成球实验发现,敲低KAT5能够明显抑制MG63和U2OS细胞的成球能力;Western blot实验结果显示,敲低KAT5能够明显抑制细胞干性标志蛋白Sox-2、Oct3/4和Nanog的表达水平。5、QRT-PCR和Western blot结果发现,左旋布比卡因能够明显抑制MG63和U2OS细胞中MAFB的表达水平。6、在左旋布比卡因处理且同时过表达KAT5后,Ch IP实验结果显示,KAT5在MAFB启动子区的富集水平显著提高;QRT-PCR和Western blot结果发现,MG63和U2OS细胞中MAFB的表达水平明显高于左旋布比卡因单独处理组。此结果提示左旋布比卡因通过抑制KAT5的表达来下调MG63和U2OS细胞中MAFB的表达。7、左旋布比卡因处理联合KAT5过表达能够明显促进MG63和U2OS细胞的增殖能力、细胞成球能力及细胞干性标志蛋白的表达,同时降低MG63和U2OS细胞的凋亡水平。8、左旋布比卡因处理联合MAFB过表达能够明显促进MG63和U2OS细胞的增殖能力、细胞成球能力及细胞干性标志蛋白的表达,同时降低MG63和U2OS细胞的凋亡水平。9、左旋布比卡因能够降低小鼠肿瘤组织中KAT5/MAFB轴的表达水平。结论:1、左旋布比卡因能够显著抑制OS细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭、细胞干性、体内成瘤及远位转移等恶性生物学行为。2、左旋布比卡因通过抑制KAT5的表达来拮抗KAT5和MAFB的结合能力,进而降低MAFB的表达水平,最终抑制OS的疾病进展。