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以国光×特拉蒙杂交后代柱型和普通型苹果(MalusdomesticaBorkh)组培苗为试材,分别进行不同浓度和不同天数的外源GA3处理,测定不同浓度GA3处理后组培苗的酶活性、内源激素含量的动态变化。以柱型和普通型苹果茎尖为试材,克隆得到苹果的内根-贝壳杉烯合成酶(Ent-kaurenesynthase,KS)基因和古巴焦磷酸合酶(Copalylpyrophosphatesynthase,CPS)基因,并对这两个基因进行组织表达和生物信息学分析,以期探讨苹果赤霉素合成途径上游的调控机制。获得的研究结果如下:
1.外施GA3明显促进苹果组培苗新梢的生长,柱型苹果对GA3的反应较普通型苹果不敏感。外施GA3能明显提高柱型苹果α-淀粉酶活性,普通型苹果反应相对不明显;高浓度的GA3对SOD酶活性有抑制作用,随处理天数先抑制后促进,不同的是,与对照组相比,GA3处理抑制柱型苹果SOD酶活性促进普通型苹果SOD酶活性;外施GA3后柱型苹果的POD酶活性高于普通型苹果,随处理天数大致表现上升趋势。
2.内源激素的测定结果表明,柱型苹果组培苗IAA含量低于普通型植株,外施低浓度GA3显著提高了柱型苹果IAA含量,高浓度则抑制;而外施GA3降低了普通型苹果IAA含量,随处理天数大致呈上升趋势;柱型苹果组培苗ZR含量高于普通型植株;外施GA3略微降低了柱型苹果ZR的含量,高浓度的GA3抑制作用更为显著,普通型苹果ZR含量前16d变化不明显;柱型苹果ABA含量高于普通型,外施GA3前8d柱型和普通型苹果ABA含量均显著降低,之后上升;柱型苹果GA3含量略低于普通型植株,外施GA3提高了两种株型的内源GA3含量,且随处理天数大致呈上升趋势;柱型和普通型苹果GA4含量差别不明显,外施GA3后两种株型GA4含量均显著上升,且上升程度均大致与外施GA3的浓度呈正相关。
3.以苹果茎尖为试材,同源克隆得到KS的cDNA全长序列,命名为MdKS,开放阅读框(ORF)全长2214bp,编码737个氨基酸,推断相对分子量为83.7244kDa,等电点为5.47;氨基酸同源性及聚类分析表明,MdKS与已报道的其它11种植物的KS氨基酸序列具有52%-98%的相似性,该基因最先和梨聚类,其次是板栗;MdKS属于萜类合成酶亚家族,具有DDXXD结构域。
4.从柱型苹果中克隆得到CPS基因2187bp的cDNA片段,氨基酸序列同源性及聚类分析表明,MdCPS与板栗属于同一进化支,同源性达69%,与毛果杨属于同一分支,同源性为68%;MdCPS也属于植物萜类合成酶家族,与MdKS具有相同的保守结构域YDTAWVAMVP,MdCPS可能定位于细胞质。
5.Real-timePCR分析表明,在苹果的生长季节,MdK和MdCPS基因在柱型和普通型苹果中均能表达。在苹果的生长初期,普通型苹果MdKS和MdCPS基因的表达量均明显高于柱型苹果,而在6月初,其表达量却略低于柱型苹果。