淡水蟹类是短尾类进化历程中最年轻的一个分支,它们由海洋蟹类祖先演化而来,完全适应了淡水生活。在向淡水生境拓展的历程中,淡水蟹类面临着巨大的生存压力,以至于它们无论在形态构造、生活史模式还是生理上都发生了很大的适应性变化,而盐、水平衡调节是其面临的最关键的挑战。淡水蟹类的渗透压调节主要通过排出涌入体内的大量渗透性水,同时减少体内盐分在排水过程中的被动丢失来维持其体内生理环境的稳态。生理解剖学及组织学的研究表明淡水蟹类从海洋到淡水的进化过程中,其渗透压调节已经形成了生理适应,然而这一适应性的分子机制尚不清楚。鉴于此,本文选择7条渗透压调节相关基因作为候选基因。首先,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测不同盐度梯度下7条候选基因在长江华溪蟹(Sinopotamon yangtsekiense)鳃组织中的差异表达情况,以验证这些基因与华溪蟹为代表的淡水蟹类渗透压调节的相关性;其次,以前述研究验证的7条候选基因中获得成功扩增的5条作为靶基因,以我国2科18属21种淡水蟹类为研究对象,并以9科11属17种海洋蟹类作为背景类群,通过同源序列的比较和分子进化分析,探讨淡水蟹类在适应淡水生境的历程中其渗透压调节基因是否发生了适应性进化。7条渗透压调节相关基因包括编码三类功能蛋白的基因:离子转运蛋白,如:Na+/K+-ATP 酶 α 亚基(Na+/K+-ATPase α subunit)、V-ATP 酶(V-type proton ATPase)、碳酸酐酶(CA)和电压依赖型阴离子通道蛋白(VDAC)这4种蛋白;热激蛋白,如:热激蛋白90(HSP 90)和热激蛋白70(HSP 70);以及14-3-3蛋白。本实验研究表明,在不同盐度梯度(0、5‰60、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰)下,7条渗透压调节相关基因在长江华溪蟹鳃组织中表达差异显著。随着盐度梯度的增加,编码离子转运蛋白的基因中,离子转运基因Na+/K+-A TPase a subunit、V-type proton ATPase和VDAC的表达量呈现先增加后微降的趋势,而C4c的表达量则有下降的趋势;于此同时,与胁迫相关的热激蛋白编码基因(hsp 90、hsp 70)及14-3-3的表达量均呈现显著增加的趋势。此外,本文驯养实验显示,长江华溪蟹通过逐级盐度梯度的驯养后,能够在相当于海水盐度的水体中长时间生活达125天,提示这类真淡水蟹对海水具有很强的耐受能力。论文还对其中的5条基因进行了 PAML选择压力分析,结果发现,Na+/K+-ATPase α subunit、VDAC、hsp 90及14-3-3在淡水蟹类中经历了正选择作用。从功能来看,Na+/K+-ATP酶是维持细胞内外渗透压和离子平衡的关键酶,电压依赖型阴离子通道蛋白可调节细胞代谢及ATP/ADP的转换,14-3-3蛋白调控相关离子通道。这些基因均受到正选择作用可能与淡水蟹类渗透压调节机制的改变有关。热激蛋白90作为分子伴侣在生物体的应激反应中具有重要的作用,本文从淡水蟹类的hsp 90基因检测到正选择作用,推测淡水蟹类从海洋向淡水生境的拓展过程中,其热激蛋白90高表达可有助于其机体有效应对崭新的淡水生活。此外,本文通过至少两种最大似然法检测的13个正选择位点中,有11个位点发生了激进型氨基酸的改变,且这些位点均散布在淡水蟹类支系中,提示淡水蟹类渗透压调节相关基因的适应性进化普遍显现于淡水蟹类的支系分化过程中。本文首次验证了 7条渗透压调节相关基因在以华溪蟹为代表的真淡水蟹类中的差异表达情况;并通过分子进化分析揭示了淡水蟹类4条渗透压调节相关基因受到正选择作用。提示淡水蟹类在应对低渗的淡水环境的进化过程中,通过相关功能基因的分子进化,最终发展出了有效适应淡水环境的渗透压调节机制。本文研究结果为揭示淡水蟹类适应淡水生活的进化机制提供了新的分子证据。