众所周知,我国既是抗生素生产大国,也是抗生素使用大国。畜牧和水产养殖、医院及抗生素药厂、以及垃圾填埋场、污水处理厂的废水废物排放都在不同程度上带来环境抗生素污染。而且大部分抗生素无法在现有工艺下有效去除,导致河湖水体成为抗生素和耐药基因库。权威专家呼吁尽快把抗生素威胁纳入国家安全监控体系,解决环境中抗生素残留问题已刻不容缓。利用微生物降解环境中的抗生素不仅可以有效的解决其在环境中的残留问题,还能避免对环境造成二次危害。因此,本文首先分离筛选四环素、土霉素和磺胺嘧啶的高效降解菌株;通过对菌株代谢产物的分离纯化,对菌株起抗生素降解作用的物质种类与性质展开分析;通过HPLC分析、ESI-MS相结合的方法检测降解产物的分子式结构,据此并推导降解途径,并检验抗生素降解产物的安全性。在探明菌株降解特性的基础上,将菌剂添加于腐熟菌剂中构建成复合菌剂,考察该复合菌剂应用于粪便堆肥技术的可行性。主要结果如下:1、通过富集培养、平板初筛以及HPLC定量测定等方法,从养殖场粪便、污水、土壤等样品中分离筛选出一株命名为“N2-13”的菌株,四环素降解率为73.88%,经过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因检测后鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyoliquefaciens)。筛选一株命名为“N2-18”的菌株,土霉素降解率为60.47%,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。筛选到一株命名为“T-14”的菌株,磺胺嘧啶降解率为63.72%,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对上述三株菌株展开后续研究。2、研究菌株的降解特性及产酶条件。通过单因素试验对菌株展开降解特性及产酶条件研究,考察pH、无机盐、处理时间、菌量和溶氧等因素对四环素、上霉素、磺胺嘧啶降解菌株的影响。结果表明:在pH7.0、装液量100 mL、添加0.03%FeSO4、接种量为2%、37℃的条件下培养3d后,N2-13菌株对四环素的降解率可达97.27%;在pH7.0、装液量100 mL、添加0.03%FeSO4、接种量为5%、37℃的条件下培养3d,N2-18菌株对土霉素的降解率可达94.4%;在 pH7.0、装液量100 mL、添加 0.03%FeS04、接种量为 3%、37℃的条件下培养3 d,T-14菌株对磺胺嘧啶的降解率可达72.35%。3、对降解菌株的中间代谢物展开分析,分离纯化其降解酶。通过硫酸铵分级沉淀试验、葡聚糖凝胶G-200对菌株所产降解酶进行分离纯化。结果表明:N2-13菌株所产的四环素降解粗酶,其蛋白质大小范围在14 kDa-22 kDa,包含6-7个条带;N2-18菌株所产的土霉素降解粗酶,其蛋白质大小范围在31 kDa-43 kDa,包含4个条带;T-14菌株所产的磺胺嘧啶降解酶,其蛋白质大小在33 kDa左右,有 1个条带。4、鉴定四环素、土霉素、磺胺嘧啶降解产物的分子式结构,推导其降解途径,并检测产物的抑菌能力。利用上述纯化所得的降解酶与相应抗生素反应后,通过HPLC收集降解产物,ESI-MS检测分子式结构并推导降解途径。结果显示:该四环素降解酶可产生3种降解产物,为m/z415、m/z369、m/z312,据此初步推断出四环素的3种降解途径、6种降解步骤:脱甲基、脱氨基、氧化、脱甲基、脱酰胺基、脱水;该土霉素降解酶可产3种降解产物,为m/z543、m/z369和m/z431,初步推断出土霉素的3种降解途径、7种降解步骤:羟基化、脱甲基、脱水、脱氨基、脱羰、仲醇氧化、苯环裂解;该磺胺嘧啶降解酶可产2种降解产物,为m/z143和m/z283,初步推断出磺胺嘧啶的2种降解途径、4种降解步骤:S-N键水解、脱氢、羟基化、脱氨基。5、探明了四环素、土霉素、磺胺嘧啶降解菌株的药物敏感性与降解产物的安全性。利用抑菌圈法检测四环素、土霉素、磺胺嘧啶降解后所得的降解产物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌的抑菌能力。结果显示:四环素降解产物m/z369、产物m/z415、m/z312对上述四种病原菌的抑制能力显著性降低;土霉素降解产物m/z 369、产物m/z 543、产物m/z 431对上述四种病原菌的抑制能力显著性降低;磺胺嘧啶降解产物m/z283、产物m/z143对上述四种病原菌的抑制能力显著性降低。即三种抗生素经过降解后所得的产物对上述4种病原菌的抑菌能力均显著弱于降解前。降低了三种抗生素的降解产物对环境可能带来的生物安全风险。根据农业部标准NY1 109-2017中所规定的方法,选取六种抗生素即:氨苄青霉素、多西环素、环丙沙星、硫酸链霉素、复方磺胺甲恶唑、头孢唑林铵,检验其对四环素、土霉素、磺胺嘧啶降解菌株的抑制能力。结果表明四环素降解菌N2-13、土霉素降解菌N2-18、磺胺嘧啶降解菌T-14均符合农业部相关安全规定,可投入农业生产使用。此结果确定了四环素降解菌N2-13、土霉素降解菌N2-18、磺胺嘧啶降解菌T-14的菌种药物敏感性。6、对菌株展开实际应用效果研究。将降解菌剂与腐熟菌剂科学配比制成复合菌剂。在人为模拟的含抗粪便中接入复合菌剂进行混合堆肥发酵,通过对各项指标的检测,以考察三种降解菌株在粪便堆肥技术中的应用潜力。结果显示:四环素降解菌N2-13组成的复合菌剂在堆肥结束后,对四环素的降解率为94.51%,能有效促进堆体温度提前达到高温期并加速堆体腐熟,在堆肥末期,堆体全氮量增加了 1.14%、有机质含量减少至45.42%,种子发芽指数达到80%以上,符合国家无害化有机肥料要求:土霉素降解菌N2-18在堆肥结束后,其对土霉素的降解率为86.22%,能有效促进堆体温度提前达到高温期并加速堆体腐熟,在堆肥末期,堆体全氮量增加了1.06%、有机质含量减少至43.83%,种子发芽指数达到80%以上,符合国家无害化有机肥料要求;磺胺嘧啶降解菌T-14在堆肥结束后,其对磺胺嘧啶的降解率为89.55%,能有效促进堆体温度提前达到高温期并加速堆体腐熟,在堆肥末期,堆体全氮量增加了1.07%、有机质含量减少至45.21%,种子发芽指数达到80%以上,符合国家无害化有机肥料要求。总之,三种降解菌株不仅具有良好的实际降解能力,其组成的复合菌剂对含抗鸡粪的无害化处理也具有一定的促进作用。综上所述:本研究获得了可高效降解四环素、土霉素、磺胺嘧啶三种抗生素的菌株,探索了三株降解菌株对相应抗生素的降解机理,推导了三种抗生素的降解途径,验证了降解菌株及抗生素降解产物的安全性,最后探明了其降解特性,并考察了将降解菌株应用于粪便堆肥技术的可行性与应用效果,为四环素、土霉素、磺胺嘧啶的生物降解奠定了理论基础并为实际生产研究提供了数据。