研究目的糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病（Diabetes mellitus，DM）主要并发症之一。研究提示炎症因子可能是引起糖尿病心肌损伤的原因之一,因而抑制炎症因子可能是保护糖尿病心肌损伤的重要策略之一。本课题旨在研究糖尿病大鼠心肌NF-κB-TNF-a-ICAM-1, COX-2炎症信号通路的改变，从整体、组织、细胞和分子水平深入研究糖尿病心肌损伤的病理生理机制，同时研究葛根素对上述炎症通路的干预作用，为糖尿病心血管并发症的治疗寻找新的治疗靶点和新药开发目标。研究方法1．实验性糖尿病大鼠模型的建立健康雄性SD大鼠50只，随机挑选10只作为阴性对照组，其余40只一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）60mg/kg，72h后测空腹血糖，以血糖值≥16.7mmol/L为糖尿病模型成功。造模成功8周后，检测大鼠血清AST、LDH、CK、CK-MB4种心肌酶的含量，并进行Masson三色染色判断有无心肌损伤及纤维化。2．葛根素对糖尿病心肌损伤大鼠心功能及高糖损伤心肌细胞的影响⑴将糖尿病心肌损伤大鼠随机分为模型组、葛根素小剂量组（50mg/kg）和大剂量组（200mg/kg），每组10只。每天腹腔注射给药1次,阴性对照组和模型组给予同体积的生理盐水，连续给药8周。末次给药后观察大鼠的一般情况，评价各组的体重（Body weight, BW），空腹血糖（Fasting blood glucose, FBG），总胆固醇（Total cholesterol, TC），甘油三酯（Triglyceride, TG）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase, AST）、肌酸激酶（Creatine kinase, CK）、心肌型肌酸激酶同功酶（Isoenzyme of creatinekinase, CK-MB）含量。小动物超声成像系统观测左心室舒张末期内径（Leftventricular internal diastolic diameter, LVIDd）、左心室收缩末期内径（Leftventricular internal diameter at end-systole, LVIDs）、短轴缩短率（FractionalShortening, FS）及左心室射血分数（Left ventricular ejection fraction, LVEF）的改变。用Biopec生理机能系统记录左心室内压变化速率（±dp/dtmax）。血流动力学测定后，腹主动脉取血，分离血清-20℃保存，待用。处死大鼠，迅速开胸取心脏、游离左心室称重，计算左心室质量指数（Left ventricular weight index, LVWI,LVW/BW），取左心室前壁心肌组织固定，透射电镜观察其超微结构改变。⑵取对数生长期心肌细胞分为：正常对照组：培养基中不加任何刺激物，培养24小时；高糖损伤模型组：培养基中加入终浓度为33mmol/L的高浓度葡萄糖刺激心肌细胞，培养24小时；葛根素处理组:分别加入终浓度为10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L的葛根素预处理12小时后加入终浓度为33mmol/L的葡萄糖培养12小时。应用瑞氏-吉姆萨染色观察心肌细胞形态学变化。3．葛根素对糖尿病大鼠心肌及高糖损伤心肌细胞NF-κB信号通路的影响⑴NF-κB：应用免疫细胞荧光化学检测葛根素对高糖损伤心肌细胞NF-κB表达的影响。⑵TNF-α：应用ELISA法检测葛根素对DM大鼠血清中TNF-α表达的影响。⑶ICAM-1：应用免疫组织荧光化学检测葛根素对DM大鼠心肌组织ICAM-1表达的影响；用ICAM-1/FITC标记心肌细胞，流式细胞仪检测葛根素对心肌细胞ICAM-1表达变化的影响，激发波长488nm，发射波长535nm，用Cell Quest软件进行统计分析。⑷COX-2：应用ELISA法检测葛根素对DM大鼠血清、心肌组织匀浆、高糖损伤心肌细胞培养上清及心肌细胞内COX-2含量的影响；并用免疫细胞化学法观察葛根素对高糖损伤心肌细胞COX-2表达的影响。结果1．糖尿病大鼠模型的建立与阴性对照组比较，8周末模型组大鼠血清中AST、LDH、CK、CK-MB4种心肌酶含量均显著升高（P＜0.01），Masson三色染色显示模型组冠状动脉管壁胶原纤维增多呈深蓝色。冠脉周围纤维组织增生，呈蓝色云雾状。提示DM大鼠出现心肌损伤并伴有轻度纤维化。2．葛根素对糖尿病心肌损伤大鼠心功能及高糖损伤心肌细胞的影响⑴实验期间，阴性对照组大鼠一般状态良好、健壮、皮毛有光泽，对外界反应灵敏。与阴性对照组比较，模型组大鼠逐渐出现多饮、多食和消瘦,精神萎靡,皮毛无光泽，尿量多、腥臊酮臭味加重、稀便；部分大鼠尾、足部出现皮肤破损、白内障等。与模型组比较，葛根素各剂量组（50mg/kg、200mg/kg）也出现消瘦、多饮多尿、腥臊酮臭味加重等，但症状比模型组明显减轻。⑵与模型组相比，①葛根素大剂量组（200mg/kg）体重明显升高（P＜0.01），FBG，TC，TG及AST﹑LDH、CK、CK-MB均显著下降（P＜0.01）；②葛根素大剂量组（200mg/kg） LVID值及LVIDs值明显下降（P＜0.01），FS值及LVEF值明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；③葛根素大剂量组（200mg/kg）+dp/dtmax明显升高（P＜0.01），葛根素小剂量组（50mg/kg）无显著性差异（P＞0.05）。葛根素处理组（50mg/kg、200mg/kg）均对-dp/dtmax明显降低（P＜0.01）。④葛根素大、小剂量组（50mg/kg、200mg/kg）左心室质量指数减小，尤以葛根素大剂量组（200mg/kg）减小最为明显（P＜0.01）。⑶电镜下观察显示：阴性对照组心肌纤维结构完整，肌小节排列整齐，线粒体膜完整，细胞核染色质分布均匀，横纹清晰。模型组肌小节排列紊乱，线粒体肿胀，增多，呈堆积状。心肌细胞核固缩，染色质边集，呈锯齿状。葛根素处理组（50mg/kg、200mg/kg）病变较模型组明显减轻，细胞排列整齐，线粒体排列较规则，大小较一致，肌原纤维断裂现象轻。⑷瑞氏-吉姆萨染色结果显示：与高糖损伤心肌细胞模型组比较，葛根素处理组(10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L)心肌细胞损伤明显减轻，细胞形态饱满，核膜完整，核浆比例正常。3．葛根素对糖尿病大鼠心肌及高糖损伤心肌细胞NF-κB信号通路的影响⑴免疫细胞荧光化学检测结果显示：模型组心肌细胞胞质中NF-κB红色荧光稍减弱，胞核中红色荧光着色强，葛根素处理组(10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L)可见胞质中的红色荧光较模型组强，正常对照组弱，胞核中红色荧光着色较模型组弱，较正常对照组强。⑵与模型组相比，葛根素大剂量组（200mg/kg）血清TNF-α水平明显降低（P＜0.01）。⑶免疫组织荧光化学检测ICAM-1结果显示：与阴性对照组比较，模型组和葛根素处理组（50mg/kg、200mg/kg）心肌组织ICAM-1亮绿色荧光明显增强，与模型组比较，葛根素处理组（50mg/kg、200mg/kg）随药物剂量的增加胞浆亮绿色荧光明显减弱；流式细胞仪检测结果显示：正常对照组心肌细胞ICAM-1阳性率仅为3.15%，与正常对照组比较，模型组心肌细胞ICAM-1阳性率明显升高为14.81%；与模型组比较，葛根素处理组(10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L)心肌细胞ICAM-1阳性率明显降低分别为8.24%、12.97%、11.14%。⑷与模型组相比，①葛根素大剂量组（200mg/kg）血清COX-2水平显著降低（P＜0.01），小剂量组（50mg/kg）无统计学意义（P＞0.05）。②葛根素大、小剂量组（200mg/kg、50mg/kg）心肌组织匀浆中COX-2明显降低（P＜0.01）。与高糖损伤心肌细胞模型组比较，①葛根素各浓度组(10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L)心肌细胞培养上清液中COX-2明显降低，均有统计学意义（P＜0.01）。②葛根素高浓度组(1×10^-4mol/L)和低浓度组(1×10^-6mol/L)心肌细胞内COX-2水平显著降低（P＜0.01），中浓度组(1×10^-5mol/L)心肌细胞内COX-2水平虽有所降低但无统计学意义（P＞0.05）。⑸免疫细胞化学法显示：与高糖损伤心肌细胞模型组比较，葛根素处理组(10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L)COX-2的表达随药物浓度的增加胞浆棕黄色颗粒明显减少，以高浓度组(1×10^-4mol/L)、中浓度组(1×10^-5mol/L)最为明显，低浓度组(1×10^-6mol/L)变化不大。结论1.STZ糖尿病大鼠成模8周后，出现心肌损伤且伴有轻度纤维化。2.葛根素对糖尿病引起的大鼠心肌超微结构损伤及伴有的心脏收缩和舒张功能障碍有一定的改善作用。3.使用葛根素预处理可以减轻高浓度（33mmol/L）葡萄糖引起的心肌细胞损伤，提示其具有保护心肌细胞的作用。4.与阴性对照组比较，糖尿病心肌组织及高糖诱导心肌细胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、COX-2的表达均明显升高。5．葛根素对糖尿病心肌损伤具有保护作用，其机制可能与降低心肌组织和（或）血清和（或）细胞培养上清和（或）细胞内NF-κB、TNF-α、ICAM-1、COX-2的表达有关。