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机体的天然免疫系统在抵抗病毒感染方面发挥着重要作用。病毒感染宿主细胞后，宿主细胞可以通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)侦测病原相关分子模式(pathogen-assoeiated molecular patterns，PAMP)的存在，从而激活宿主的天然免疫反应，诱导干扰素(IFN)、促炎症细胞因子等一系列抗病毒因子的产生。RIG-I是一类新发现的PRR，能够识别病毒RNA组分，并通过自身的CARD结构域和下游信号分子IPS-1的CARD结构域的直接相互作用来传递信号。激活转录因子IRF-3和NF-κB，使其进入细胞核内，诱导干扰素的表达，从而启动先天性免疫反应和调节随后的获得性免疫反应，增强机体抵抗病毒的能力。 近些年虽然对人、小鼠、猪等哺乳动物细胞中的RIG-I介导的抗病毒天然免疫反应的研究较为深入，但有关鸭RIG-I的研究鲜有报道。随着RIG-I被证实在鸭中存在，而同为禽类的鸡却没有RIG-I基因，鸭RIG-I在抗病毒天然免疫中的作用引起了广泛的关注。鉴于此，本研究对鸭RIG-I在诱导I型干扰素中的作用做了初步探索。 本研究采用融合PCR方法，从北京鸭脾脏中扩增得到RIG-I基因cDNA。序列分析发现，北京鸭的RIG-I基因cDNA开放阅读框全长2802bp，编码933个氨基酸组成的多肽。结构预测发现鸭RIG-I结构与哺乳动物的类似，N端有两个串联CARD区，中间为DExD/H解旋酶区，C端为抑制区，各功能区起重要作用的氨基酸较为保守。同源性及进化树分析发现鸭RIG-I与鹅和斑马鱼的同源性最高分别为93.7％、78.4%，与哺乳动物的同源性高于50%，与其它鱼类的同源性低于50%。 本研究中，将鸭RIG-I CARD区克隆到pET-28a原核表达载体中，通过诱导剂梯度、诱导时间梯度等条件优化，在IPTG浓度为0.6 mmol/L、诱导时间为6h时，pET-28a-CARD得到了有效的表达。 本研究设计并筛选出了用于检测IFN-α、IFN-β、IRF-3、NF-κB、RIG-I、MDA5、Mx-1、PKR、GAPDH等信号因子的扩增引物。通过在线数据库预测并结合试验验证，成功构建IFN-β启动子报告质粒PGL3-IFNβ-P、IFN-β启动子IRF结合位点报告质粒pGL3-IRF-B1、pGL3-IRF-B2和NF-κB结合位点报告质粒pGL-NF-κB-B，并构建了含有Mx-1启动子及其ISRE的报告质粒pGL3-Mx-p、pGL3-ISRE，转染试验证明所构建的报告质粒均能有效的工作。 将鸭RIG-I在DF-1细胞中过量表达，并使用Poly(I：C)刺激，通过荧光定量和双报告基因系统检测，发现鸭RIG-I的过表达能有效的激活RIG-I介导的I型干扰素信号通路。将CARD区不同长度的突变体质粒在DF-1细胞中过表达，发现1-187位氨基酸是CARD区发挥信号传递作用的最佳长度，1-185位氨基酸是发挥信号传递作用的最短长度，1-184位氨基酸则不能诱导I型干扰素的产生。将鸭RIG-I的不同功能区(CARD区、解旋酶HR区、抑制区RD)分别在DF-1细胞中过表达，RIG-I在没有外源病原刺激时，诱导IFN-β的能力较弱，poly(I：C)和禽流感病毒均可增强其诱导IFN-β的能力。有无外源刺激(禽流感病毒、poly(I：C))CARD区均可有效的诱导IFN-β的表达，而HR区和RD区则无诱导IFN-β的能力。 本研究将CARD区第8位丝氨酸(Ser8)分别突变为酸性氨基酸天冬氨酸(S8D)、谷氨酸(S8E)模拟磷酸化状态，突变为中性氨基酸丙氨酸(S8A)和碱性氨基酸赖氨酸(S8K)、精氨酸(S8R)模拟非磷酸化状态，发现S8D、S8E大大降低了RIG-I诱导IFN-β的能力(p<0.01)，S8K、S8R也较大成程度的降低了RIG-I诱导IFN-β的能力，S8A轻微的降低了RIG-I诱导IFN-β的能力。因此我们推测，在鸭RIG-I中8位丝氨酸的磷酸化在RIG-I信号通路中作为一种负调控机制存在。