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高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI)被国际动物卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病,也被国际生物武器公约列入动物类传染病名单,该病毒血清型多,变异性强,目前疫苗免疫仍为预防该病最有效地办法。DNA疫苗作为一种新型的基因工程疫苗,有着传统疫苗无法替代的优势,如诱导机体广泛的免疫应答；免疫持久性；易于构建成联合疫苗、多价疫苗或嵌合疫苗等,但是DNA疫苗的安全性问题仍值得重视,其中DNA疫苗是否能和基因组DNA整合是安全性研究中的重点。禽流感H5亚型DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5以10μg低剂量免疫不仅可以达到100%的免疫保护,其有效免疫保护也可以持续一年以上。为揭示DNA疫苗pCAGGoptiHA5长期持续免疫的机理本研究采用荧光定量PCR法明确DNA疫苗免疫后质粒DNA在鸡体的分布、定位与持续时间,并用southern杂交法判断DNA疫苗是否与鸡基因组DNA发生重组。根据禽流感DNA疫苗pCAGGoptiHA5 HA基因保守序列,分别针对SYBR Green I实时定量PCR和TaqMan MGB实时定量PCR法设计特异性引物和探针,选取DNA疫苗pCAGGoptiHA5作为标准品并建立两种定量方法,在优化的条件下比较特异性,敏感性,重复性和污染率。结果表明两种方法标准曲线线性关系都较好,相关系数都能达到0.999以上；最低检测量为42copies,特异性强；探针法各稀释度重复性都好于染料法,污染率低于染料法。采用TaqMan MGB实时定量PCR法检测禽流感DNA疫苗在蛋鸡体内各组织分布情况,试验分为pCAGGoptiHA5单免组、pCAGGoptiHA5加免组、PBS对照组和空载体对照组,并分别于免疫后1h、1d、7d、14d、30d (M1)、60d (M2)、90d (M3)、120d (M4)、150d (M5)、180d(M6)、210d (M7)、240d (M8)、270d (M9)、300d(M10)、330d (M11)、360d(M12)采集心肌(he)、肝脏(li)、脾脏(sp)、肺脏(lu)、肾脏(ki)、胃(st),肠(in),免疫部位肌肉(mu)和脑(br),提取基因组后采用TaqMan MGB实时定量PCR法检测pCAGGoptiHA5在各组织的分布情况,结果表明免疫后一年内所有检测时间点各组织都能检测到质粒pCAGGoptiHA5,PBS对照组和空载体对照组在所有时间和组织都未能检测到质粒pCAGGoptiHA5,加强免疫后各组织质粒含量明显增加；注射部位肌肉在免疫后1小时质粒含量达到顶峰,肝,脾,肾,胃,肠,脑质粒含量在免疫后1天达到顶峰,心和肺质粒含量在免疫后7天达到顶峰,随后全部平稳下降；所有组织中,脑部质粒清除的最快,360天只剩1.83拷贝数对数/ug(67copies/μg)，而肠质粒清除率最慢,360天时还能检测出4.48拷贝数对数/ug(30300copies/μg)。为确定DNA疫苗能否与基因组DNA发生整合,将pCAGGoptiHA5产物回收后标记DNA探针,确定探针敏感性后对30d、120d和360d各组织DNA进行southern杂交分析,判断质粒DNA是否与基因组DNA发生整合,结果表明在探针敏感性范围内,未发现基因组DNA与质粒DNA发生整合,这与国内外大部分研究结果相同。本研究首次证实了禽流感DNA疫苗pCAGGoptiHA5在蛋鸡体内能持续一年之久,明确了DNA疫苗免疫后质粒DNA在机体的分布与定位情况和与基因组DNA整合可能情况,为揭示DNA疫苗免疫后长期免疫持续的机理和H5亚型禽流感DNA疫苗的产业化提供相关理论指导。