论文部分内容阅读
氧化损伤是指动物体内氧化和抗氧化作用的平衡被打破,过量自由基对机体造成的损伤。水产动物是变温动物,其中的甲壳类具有开放式循环系统,其健康状态极易受到所处的复杂多变的水环境的影响。随着大规模集约化养殖的发展,由氨氮、病原菌等各种环境因子造成的氧化应激损伤严重制约着水产养殖业的可持续发展。通过在饲料中添加抗氧化剂来提高水产动物的健康程度是缓解这一问题的重要途径。嗜盐古菌(Haloarchaea)是一类广泛分布于日晒盐场、盐湖等高盐环境的原核微生物。嗜盐古菌具有适应极端条件的渗透压调节机制和特殊代谢途径,能够合成类胡萝卜素、聚羟基丁酸酯和多糖等生物活性物质,具有广泛的生物技术应用前景。C50类胡萝卜素是嗜盐古菌的主要类胡萝卜素,具有高效的自由基清除活性。但是对于古菌及其类胡萝卜素的研究和开发并不深入,且尚未有其在动物健康领域中应用的研究报道。本文通过发酵获得大量嗜盐古菌Halorubrum sp.IT-4菌体,对其色素粗提物进行分离纯化和成分鉴定,在明确其化学抗氧化活性的基础上,以经济甲壳动物凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和淡水经济鱼类金鳟(Oncorhynchus mykiss)为研究对象,在明确嗜盐古菌及其类胡萝卜素对于水产动物生长、体色和健康状态发挥积极作用的基础上,研究古菌类胡萝卜素对水产动物抗氧化系统的调控机制,为将其开发为天然抗氧化剂提供理论基础。本论文的主要研究结果如下:1.Halorubrum的发酵和色素粗提液的主成分分析对分离于高盐水体的一株嗜盐古菌Halorubrum sp.IT-4(保藏编号为CGMCC No.17350)进行中试规模(300 L)发酵,获得菌体湿重产量81.73 g/L和16.67 mg/L古菌类胡萝卜素产量。利用TLC、HPLC-MS对Halorubrum色素粗提液进行分离并对主要组分定性分析,证明了Halorubrum合成的C50类胡萝卜素以菌红素及其衍生物为主,包括菌红素(84.12%)、单脱水菌红素(15.14%)、双脱水菌红素和三脱水菌红素(0.64%)。2.Halorubrum类胡萝卜素体外抗氧化活性研究在体外体系中研究Halorubrum类胡萝卜素对AAPH和Fe2+/H2O2诱导的DNA和蛋白质氧化损伤的保护作用,表明其具有保护DNA和蛋白质大分子的作用,且在Fe2+/H2O2损伤体系中保护作用呈现浓度依赖性,效果优于虾青素。3.Halorubrum菌体对凡纳滨对虾仔虾抗应激的影响利用水产生物饵料卤虫(Artemia franciscana)作为生物胶囊,通过强化的方式将Halorubrum菌体投喂给凡纳滨对虾仔虾。研究结果表明,投喂Halorubrum菌体可以提高仔虾的存活和生长,增强仔虾对高盐度胁迫的抵抗力。高浓度氨氮暴露后,投喂Halorubrum菌体的对虾存活率显著提高(P<0.05),肝胰腺丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05)。因此Halorubrum菌体可以通过提高对虾的抗氧化能力来增强其对环境胁迫的抵抗力。4.Halorubrum类胡萝卜素对凡纳滨对虾幼虾抗氧化机制的研究在凡纳滨对虾饲料中添加50 mg/kg的古菌类胡萝卜素,研究其对凡纳滨对虾幼虾生长和抗氧化能力的影响及其分子机制。结果表明,饲料中添加50 mg/kg古菌类胡萝卜素显著提高了凡纳滨对虾肌肉和虾壳中虾青素含量(P<0.05),同时显著提高了对虾肝胰腺总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,显著降低了脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量(P<0.05),但对于对虾的生长性能和肌肉营养并没有显著影响(P>0.05)。根据摄入古菌类胡萝卜素后对虾的生长性能,相关抗氧化指标变化及其抗应激能力,分析其影响的关键基因及主要信号通路。对虾肝胰腺转录组分析表明,古菌类胡萝卜素提高对虾抗氧化能力的机制与抑制ROS的生成和激活Keap1-Nrf2信号通路有关。古菌类胡萝卜素还能够激活对虾体内相关代谢途径,调控对虾对糖类、蛋白质和脂类的利用。实验组对虾肝胰腺中有3个与类胡萝卜素代谢相关的基因表达显著上调(P<0.05),分别是两种β胡萝卜素加氧酶(βCDIOX和BCO2)和类胡萝卜素异构酶(Nina B),结合对虾肝胰腺呈现红色和虾青素含量推测古菌类胡萝卜素能够在对虾体内发生裂解代谢并转化为虾青素。5.Halorubrum类胡萝卜素对金鳟幼鱼抗氧化能力的研究在金鳟鱼饲料中添加25 mg/kg和50 mg/kg的古菌类胡萝卜素,研究其对鱼类生长性能、皮肤颜色和机体抗氧化能力的影响。结果表明,古菌类胡萝卜素可以促进金鳟皮肤色素沉积,使皮肤黄度值(b*)显著增加,且皮肤中总类胡萝卜素含量显著提高(P<0.05)。添加古菌类胡萝卜素显著增加了幼鱼血清总抗氧化能力(T-AOC)和肝脏GSH-Px酶活性(P<0.05),肝脏中脂质过氧化产物MDA含量则显著降低(P<0.05),但是对于鱼的生长性能和肌肉营养成分没有显著影响(P>0.05)。另一方面,古菌类胡萝卜素通过促进抗炎因子(TGF-β)和抑制促炎因子(IL-1β)的表达来减轻幼鱼肝脏的炎症反应,增强幼鱼对病原菌感染和氨氮胁迫的抵抗力。本论文研究明确了古菌类胡萝卜素对水产动物的抗氧化作用和调控机制,开发了其在水产养殖中的应用潜力,为新型的古菌类胡萝卜素资源开发提供了理论依据。