基于金纳米粒子标记的生物分析新方法研究

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金纳米颗粒由于其独特的物理化学性质和良好的生物相容性备受研究者的青睐。近年来,金纳米颗粒作为一种优异的光学探针广泛用于生化分析和诊断治疗等领域。本论文基于金纳米颗粒的高散射特性,以金纳米颗粒为标记探针,发展了免疫分析甲胎蛋白(AFP)和核酸适配体测定凝血酶的新方法,主要工作如下:AFP是一种癌症标志物,其临床检测在肝癌诊断中具有极重要的意义。我们采用磁珠-金纳米粒子夹心免疫分析模型,和共振散射光谱检测方法,建立了AFP免疫分析新方法。首先将两种抗体分别与磁珠和金纳米粒子连接。当抗体修饰的磁珠和金纳米粒子加入到含有AFP的样品中,夹心免疫复合物将会生成。利用磁珠的恒久磁分离性将夹心复合物与未反应的金纳米探针简便分离,用共振散射光谱来测定金纳米探针在特定波长下的共振散射光强度,从而间接测定靶目标AFP的浓度。我们优化了如抗体修饰比例、磁珠浓度、金纳米探针浓度等实验条件的影响。在优化的条件下,夹心反应中游离金纳米探针的共振散射光强度与AFP的浓度呈现良好的线性关系。该方法的线性范围为13.6pM~436pM,最低检测限达13.6pM。进而,该方法成功地用于健康人和癌症病人血清中AFP的浓度的测定。同时,该方法与标准方法ELISA实验结果进行对照,结果表明两种方法基本一致。我们的方法将有望应用于AFP含量测定的临床诊断,对于癌症前期诊断治疗大有裨益。基于aptamer分子识别原理和单个纳米粒子计数方法,我们发展了均相分析凝血酶的新方法。我们将两种能与凝血酶特异性结合的核酸适配体aptamer标记到金纳米颗粒表面。将金纳米粒子修饰的aptamer加入到含有凝血酶的样品中,aptamer将与凝血酶反应,生成夹心复合物(二聚体甚至多聚体),因而导致溶液中金纳米粒子的个数的减少,单个纳米粒子计数器能够根据微区中光子爆发数减少进行测定。我们在本课题组针对单颗粒计数法的研究的基础上做了数据处理方面的改进使获得的数据更为可靠,并考察了金纳米探针修饰比例、凝血酶与aptamer的反应时间、单颗粒计数法的检测时间等实验条件,最终获得光子爆发数与凝血酶浓度之间的良好的线性关系,检测范围为3.1nM~100nM。我们的方法将在生化分析的研究领域中具有很大发展前景。
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