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疟疾仍然严重威胁着人类的健康。世界卫生组织在2008年的疟疾报告中指出,2006年全世界大约有247,000,000人感染疟疾,其中约1,000,000人死亡；并且,死亡患者大多数是撒哈拉沙漠以南非洲地区的五岁以下儿童。随着疟原虫抗药性和蚊媒抗杀虫剂的出现和扩散,研发安全有效的疟疾疫苗已经成为未来疟疾防治的一种潜在的重要手段。恶性疟原虫融合抗原-2.9(Plasmodium falciparum chimeric protein-2.9, PfCP-2.9)是由恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(Merozoite surface protein 1, MSP1)的C末端19kDa片段(PfMSPl-19)和恶性疟原虫顶端膜抗原-1(Apical membrane antigen-1, AMA-1)的Ⅲ亚区(PfAMA-1 (III))通过一段28个氨基酸的连接序列融合而成。在动物实验中,该融合抗原比其两个单组分具有更强的免疫原性和更高的体外抑制疟原虫生长效力。该疫苗的临床试验结果也表明,疫苗安全、耐受性好,并且具有较强的免疫原性。为探索该疫苗增强免疫应答的机制,我们利用定点突变的方式,采用Western Blot和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)相结合的检测方法分析该疫苗抗原的表位分布及其可能的功能。为了解PfCP-2.9的表位分布,我们共设计了该抗原的17个单氨基酸突变体。这些突变位点有9个位于AMA-1 (III)组分,8个位于MSP1-19组分。AMA-1 (III)组分上的突变位点主要选择疟原虫种间高度保守的氨基酸位点,或者被单抗FS.12.19识别的氨基酸位点。该单抗虽然没有体外抑制活性,但是参与了不同疟原虫种间的交叉反应,而这种交叉反应被认为是抑制疟原虫入侵红细胞的机理之一。MSP1-19组分上的突变位点主要选择该抗原上已被确认的阻遏性位点,或者是在晶体结构中暴露于分子表面并且极有可能参与阻遏性或者抑制性表位形成的氨基酸位点。按照上述所设计的突变位点,我们采用重叠延伸聚合酶链反应(Overlap-extention Polymerase Chain Reaction)的方法,对pfcp-2.9基因分别进行定点突变。具体方法是：采用通用引物和相互重叠的两条突变引物中的一条,分别扩增出上、下游含突变位点的片段,再通过第二轮PCR,以纯化后的上、下游片段为模板,以两端的两条通用引物为引物,扩增产生突变体基因。将各突变体基因通过酶切,克隆到表达载体pPIC9K上,转化毕氏酵母(GS115),经过G418筛选后,在毕赤酵母中进行了分泌表达。在采用SDS-PAGE及Western Blot进行表达产物的检测中(以兔抗-PfCP-2.9为一抗),17个突变体基因均能在该表达系统中稳定表达出完整的蛋白,并能与PfCP-2.9免疫血清反应。这为进一步鉴定PfCP-2.9的表位分析提供了基础。本实验室已制备了一组(共12株)PfCP-2.9的单克隆抗体。此外,从其它实验室获得一株单抗。这些单抗识别PfCP-2.9抗原的不同表位,具有不同的生物学特性和功能,包括识别线性表位或构象表位、具有抑制疟原虫入侵或阻遏该抑制作用等。采用Western Blot和ELISA方法,通过检测各单抗与各PfCP-2.9突变体的结合反应,分析这些单抗识别的表位及其分布。结果显示：(1)一株抑制性单抗mAb7G识别的表位与三个氨基酸位点突变(M62:Phe491→Ala, M82:Glu511→Gln和M84：Arg513→Lys)相关,这三个位点均位于AMA-1(Ⅲ)的C末端非结构区(Unstructured region)的分子表面,在空间构象上彼此靠近,并且其中的任何一个位点发生突变都会使mAb7G的识别明显减弱。(2)M62和M82的突变还致使单抗mAb11.12的结合发生减弱；M62使单抗mAbW9.10的结合减弱。这些结果提示,mAb11.12(Phe491和Glu511)和mAbW9.10 (Phe491)有可能通过结合位点的相互竞争而阻断mAb7G抗体的抑制活性；(3)在针对PfMSP1-19组分的突变体设计中,有四个突变体是针对MSP1-19阻遏性表位的突变,这些突变所在的位点分别是Asn15, Glu27, Leu31和Glu43,文献报道结果表明,这四个位点的突变可以阻断四个阻遏性单抗(mAb7.5, mAb2.2,mAb1E1和mAb111.4)与PfMSPl-19结合。本实验结果显示,采用Western Blot和ELISA方法均证实,阻遏性单抗mAblEl与PfCP-2.9上述位点的突变体结合与PfMSP1-19结果一致；(4)M160突变导致对多数单抗的结合发生改变,表明该位点(Asn15)可能在PfCP-2.9分子的折叠和维持构象中发挥重要作用。为分析疟疾病人免疫血清与PfCP-2.9及其突变体的结合反应,我们收集了96份恶性疟疾病人的血清,采用ELISA方法检测这些血清样本对PfCP-2.9的识别情况。结果显示,其中91份血清识别PfCP-2.9,阳性率94.8%,表明在自然感染情况下,能产生针对PfCP-2.9疫苗抗原的特异抗体。在此基础上,我们选取其中74份阳性血清样本,比较它们与PfCP-2.9及其突变体的结合差异。结果显示,现场血清可以与大部分PfCP-2.9的突变体正常结合。但在PfMSPl-19组分上的突变体与血清结合发生了明显的改变,特别是突变其阻遏性表位的突变体(M160、M172、M176和M188),这可能缘于病人血清中存在较高水平的阻遏性抗体。这些结果为今后设计排除阻遏性表位的疫苗提供了依据。为了解PfCP-2.9突变体的免疫原性及其免疫血清体外抑制疟原虫生长的效力是否发生改变,我们将PfCP-2.9及其三个突变阻遏性表位的突变体进行发酵和蛋白纯化,获得的重组蛋白进行平行新西兰兔免疫实验。免疫血清分析结果表明,PfCP-2.9与其突变体的免疫原性,即抗体水平,无显著差异(p>0.05)。我们分离了免疫兔血清中的总IgG并进行体外抑制试验。结果表明,PfCP-2.9免疫组与突变体免疫组的免疫血清及总IgG,在体外抑制疟原虫生长效力方面无统计学差异(p>0.05)。小结：为分析PfCP-2.9疟疾疫苗候选抗原的表位及其生物学功能,我们采用重叠延伸聚合酶链反应的方法,对pfcp-2.9基因进行系列突变,制备了17个单氨基酸改变的PfCP-2.9突变体。利用本实验室前期制备的一组识别PfCP-2.9的单抗,采用Western Blot和ELISA的免疫学方法,分析单抗与突变体之间的识别反应,发现其中一些具有不同功能的单抗,其识别反应发生了改变；同时提出了其可能的生物学意义。此外,通过PfCP-2.9突变体与自然感染疟疾病人血清进行识别反应,发现其中一些突变体的识别反应发生了改变。以上结果,为阐明PfCP-2.9这个重要疟疾疫苗候选抗原的免疫保护机制,改进和设计更为有效的疟疾疫苗提供了依据和见解。