氧气是水生生物赖以生存的重要环境因子。尤其对于高密度的水产养殖产业,低氧作为常见的一种环境压力,一方面能够直接引起窒息而造成养殖鱼类的大量死亡;另一方面能够减缓鱼的生长速率,降低鱼的免疫力,使其更容易感染各种病菌,从而造成大量的经济损失。鲶鱼(Ictalurus spp.)原产于北美,不仅是美国主要的水产养殖物种,也因其优良的抗逆性、极高的营养价值和经济价值在我国被广泛养殖。相比较于很多其他的养殖鱼类,鲶鱼对低氧环境具有更好的耐受性,是一种理想的研究鱼类低氧耐受机制的物种。加之鲶鱼养殖业也同样因为低氧问题而遭受着巨大的损失,因此研究鲶鱼对低氧胁迫的响应机制,可以为选育耐低氧鲶鱼提供理论依据,对提高水产养殖业的产业效率、提高经济收入具有十分重要的意义。之前对鲶鱼耐低氧的研究主要集中在对某些特定基因。近年来,基于第二代高通量测序平台的转录组测序(RNA-Seq)技术有助于我们从整体水平上研究特定组织处于某个状态下基因转录和表达的情况。本研究之前,鲶鱼的多个组织器官(如鳃、皮肤、肠道、肝脏、肌肉、性腺等)的转录组学陆续被报道,分别揭示了与鲶鱼免疫、生长发育、性别决定等相关的机理。然而作为为鲶鱼提供平衡和浮力的器官,鱼鳔的转录组一直以来被忽略。因此本研究的第一个目的就是填补鲶鱼鱼鳔的转录组学研究的空白,从分子层面揭示鲶鱼鱼鳔的潜在功能;其次,常见养殖的鲶鱼有斑点叉尾鮰[亦称沟鲶(Channelcatfish)]、长鳍叉尾鮰[亦称蓝鲶(Blue catfish)]及二者杂交的子代(C×Bhybrid catfish)。三种鲶鱼最显著的区别之一在于鱼鳔形状的差异:Chanel catfish的鱼鳔是一个心形、没有隔膜的单室,Blue catfish的鱼鳔是一个狭长的、被隔膜从中间隔开的双室,而Hybrid catfish的鱼鳔也是双室,一端是相对较大的心形室是而另一端是相对较小的凸起。这使得鲶鱼成为研究鱼鳔形态学的很好的对象。因此本研究第二个目的就是通过比较转录组学的研究,发掘鲶鱼鱼鳔生长发育及形态差异相关的基因及其表达模式。长期以来真骨鱼的鱼鳔与哺乳动物的肺在进化学上被认为是同源器官,这个观点虽然已经从形态学和胚胎学中找寻到一定的证据,且在斑马鱼鱼鳔中有一定探究,但在分子层面仍缺乏足够的理论支持,因此本研究的第三个目的就是揭示涉及鲶鱼鱼鳔生长发育相关的重要基因及代谢通路,为鱼鳔和肺的同源性提供分子层面的理论支持;之后通过施加低氧胁迫,我们从转录组层面研究鲶鱼鱼鳔对低氧胁迫的响应,探究鲶鱼鱼鳔潜在的辅助呼吸作用及鲶鱼鱼鳔中免疫相关基因对低氧胁迫的应答规律;最后,我们基于鲶鱼鱼鳔比较转录组学的研究结果,从众多差异表达基因中选取了最具代表性之一的趋化因子(chemokine),通过生物信息学的分析方法对其进行鉴定和注释得到完整的鲶鱼趋化因子及趋化因子受体超家族,并对其进行低氧胁迫及细菌感染的表达量分析,旨在揭示鲶鱼趋化因子超家族对低氧胁迫及细菌侵染的表达响应,进而为鲶鱼低氧胁迫对免疫系统的影响提供新的视野。本论文取得如下研究成果:1.基于形状不同的三种鲶鱼鱼鳔的比较转录组学研究,发掘鱼鳔生长发育相关基因及其表达模式分析。本研究以三种鲶鱼(Channel catfish、Blue catfish 及 C ×B hybrid catfish)幼鱼(Fingerlingcatfish,4个月)、成鱼(Adultcatfish,2年)的鱼鳔为实验材料,分别构建6个转录组文库(CA、CF、BA、BF、HA及HF),并采用Illunima HiSeq v4高通量测序平台进行转录组测序,共得到转录本平均长度为100bp的原始数据115.92 Gb。通过修剪及标准化等转录组数据前处理,共有101.57Gb的数据(含1.04×1010条clean reads)被用于后续分析。将测序所得转录组数据用genome-guided方法,比对到鲶鱼基因组,计算表达量和差异表达基因(DEGs),结果显示六个转录组文库中均有超过62%的转录本可以比对到鲶鱼基因组上。基于表达量的主成分分析(PCA)显示,三种鲶鱼种间差异大于同种鲶鱼内发育阶段差异,且相比较于Channel catfish,Hybrid catfish与Blue catfish差异相对较小,表达规律更相似。同一发育阶段的Channel catfish,Hybrid catfish与Blue catfish鱼鳔转录组两两配对比较共发现4,612个显著差异表达基因。其中Channel catfish和Blue catfish鱼鳔的差异表达基因占较大比重,在幼鱼和成鱼中分别找到3,346和1,639个差异表达基因。在Channel catfish与Hybrid catfish比较转录组分析中,在幼鱼和成鱼中分别找到603和338个差异表达基因。在Blue catfish与Hybrid catfish比较转录组分析中,在幼鱼和成鱼两个时间点分别找到239和270个差异表达基因。分层聚类分析将差异表达基因分成9簇,并显示Hybridcatflsh与Blue catfish表达规律更相似。KEGG注释显示2362个差异表达基因参与涉及鱼鳔鱼鳔生长发育、结构功能相关的多个信号代谢通路中。基于差异表达基因及信号通路分析,本研究可得到如下结论:(1)相比于Channel catfish,Hybrid catfish鱼鳔转录组与Blue catfish的鱼鳔转录组基因表达规律更相似,差异表达基因数量更少,揭示了鲶鱼子代鱼鳔形态上更像父本(Paternal predominant)的遗传规律;(2)本研究所发掘的在鲶鱼鱼鳔生长发育过程中参与的Wnt信号通路和Hedgehog信号通路的某些差异表达基因在哺乳动物肺的生长发育中也起着至关重要的作用,因而在分子层面为鲶鱼鱼鳔与哺乳动物肺的同源性提供了支持;(3)鲶鱼鱼鳔转录组的差异表达基因还参与到与细胞黏附分子(Cell adhesion molecules)和黏着斑(Focaladhesion)密切相关的信号通路,以及与声波传导相关的信号通路等,全面的揭示了鲶鱼鱼鳔潜在的功能。总而言之,通过对不同形态的鲶鱼鱼鳔的比较转录组分析,我们解释了鲶鱼鱼鳔转录组的基本表达规律,发现鱼鳔的转录组表达模式与结构及功能密切相关。同时,一些和鱼鳔功能相关的重要基因和信号通路也被筛选出来,为将来更深入的鱼鳔功能研究奠定了基础。2.通过高通量转录组测序揭示鲶鱼鱼鳔对低氧胁迫的响应机制。本研究以最常见养殖鲶鱼斑点叉尾鮰(Channelcatfish)为研究对象,选取低氧胁迫后的幼年(4个月)、成年(2年)鲶鱼鱼鳔组织及空白对照组的幼年、成年鲶鱼鱼鳔为实验材料,分别构建其转录组文库,并采用Illunima HiSeq v4高通量测序平台进行转录组测序,共得到转录本平均长度为100bp的原始数据52.98 Gb。通过转录组数据前处理,共有45.53Gb的数据(含4.69×109条clean reads)被用于后续分析。将测序所得转录组数据以鲶鱼基因组为参照进行比对,结果显示六个转录组文库中均有超过三分之二的序列可以比对到鲶鱼基因组上。基于表达量的主成分分析(PCA)显示,低氧胁迫前后幼鱼鱼鳔转录组表达模式差异较大而成鱼鱼鳔对低氧胁迫响应较小。分析差异表达基因结果显示,幼年鲶鱼鱼鳔在低氧胁迫前后共发现3053个差异表达基因,其中表达上调的基因有2397个,下调的有656个。在成鱼鱼鳔在低氧胁迫前后共发现477个差异表达基因,远远低于幼鱼鱼鳔的差异表达基因数量,其中表达上调的基因有288个,下调的有189个。这些基因涉及多个和鱼鳔功能相关的信号通路,包括与鱼鳔生长密切相关的以及低氧胁迫相关的及与免疫相关的chemokine信号通路。基于差异表达基因及其所参与的信号通路分析可到如下几个结论:(1)Wnt和Hedgehog信号通路在哺乳动物肺的发育过程中起至关重要作用的两条通路,本研究在幼鱼鱼鳔的差异表达基因基因中发现多个基因参与到上述两条通路中,再次证实了鲶鱼鱼鳔与哺乳动物肺的同源性关系,然而在成鱼转录组中并未发现参与上述两条通路的基因,这说明随着鲶鱼发育完全后,参与鱼鳔发育的相关基因表达量下降;(2)参与氧气存储、氧气运输等功能的差异表达基因(如Hemoglobin)在成鱼及幼鱼中均有发现,但幼鱼中远远多于成鱼,这从基因表达量层面证明了鲶鱼鱼鳔的辅助呼吸的功能,并且我们可以推断鲶鱼鱼鳔在其幼年时有更重要的辅助呼吸作用,而成年后辅助呼吸作用变弱;(3)参与免疫作用的相关基因(如chemokine)在成鱼和幼鱼鱼鳔转录组中均观察到普遍表达量下降的趋势,这说明低氧胁迫会抑制鱼的免疫反应,使其更容易感染各种致病菌;(4)成鱼、幼鱼鱼鳔转录组中某些差异基因参与与低氧响应密切相关的HIF-1,MAPK及PI3K/Akt/mTor信号通路,揭示了鲶鱼鱼鳔对低氧胁迫的响应机理。3.从鲶鱼基因组中系统的鉴定出完整的CXCL趋化因子亚家族成员,并研究其对低氧胁迫及细菌侵染的响应。我们从鲶鱼基因组中系统的鉴定出一套完整的包含17个成员的CXCL趋化因子亚家族成员。以模式生物斑马鱼的CXCL趋化因子为参照,我们通过系统发生树分析,对这17个鲶鱼CXCL趋化因子基因进行了系统命名。这17个CXCL趋化因子包含3个CXCL8成员、3个CXCL11成员、2个CXCL12成员、1个CXCL13成员、1个CXCL14成员、3个CXCL18成员、1个CXCL19成员及3个CXCL20成员。共线性分析显示鲶鱼CXCL趋化因子所在染色体区域上下游的基因与斑马鱼对应区域基因分布结构保守,蛋白结构域分析显示这17个CXCL趋化因子成员均含有保守的CXC结构域,因此这17个CXCL趋化因子的鉴定及命名得到了验证。比较基因组学分析揭示了硬骨鱼特有的CXCL18、CXCL19、CXCL20和CXCL32成员的存在,以及由硬骨鱼三次基因组复制(3R)而导致的CXCL趋化因子数量的扩增。细菌侵染及低氧胁迫后,CXCL趋化因子呈现基因特异性表达。CXCL12a、CXCL12b、CXCL18b及CXCL20.3在爱德华氏菌(E.ictaluri)侵染后显著差异表达且均呈现上调趋势;CXCL11.3、CXCL18a.2、CXCL18b及CXCL20.3在柱状黄杆菌(F.columnare)侵染后差异表达且大部分差异表达基因上调,揭示了 CXCL11、CXCL12、CXCL18及CXCL20在鲶鱼免疫应答中潜在的的重要作用。在爱德华氏菌侵染后,CXCL11.3和CXCL20.3的表达量在抗病菌鲶鱼中显著高于易感染鲶鱼;在柱状黄杆菌侵染后,CXCL20.2的表达量在抗病菌鲶鱼中显著高于易感染鲶鱼。低氧胁迫后,CXCL12b表达量在耐低氧鲶鱼中显著高于不耐低氧鲶鱼。总而言之,CXCL11和CXCL20及CXCL12可分别用来指示鲶鱼的抗病菌感染和耐低氧性;细菌侵染及低氧胁迫会引起大部分CXCL趋化因子的高表达。4.从鲶鱼基因组、转录组及EST数据库中鉴定出完整的CCL趋化因子亚家族成员,并研究其对低氧胁迫及细菌侵染的响应。我们从鲶鱼基因组、多个转录组及EST数据库中筛选出64个CCL趋化因子亚家族成员。以模式生物斑马鱼的CCL趋化因子为参照,我们通过系统发生树分析,对这64个鲶鱼CCL趋化因子基因进行了系统命名。这64个CXCL趋化因子包含3个CCL19成员、4个CCL20成员、2个CCL25成员、3个CCL27成员、2个CCL32成员、9个CCL33成员、7个CCL34成员、1个CCL35成员、24个CCL36成员、8个CCL39成员及1个CCL44成员。共线性分析显示鲶鱼CCL趋化因子所在染色体区域上下游的基因与斑马鱼对应区域基因分布结构保守,蛋白结构域分析显示这64个CCL趋化因子成员均含有保守的CC结构域,因此这64个CCL趋化因子的鉴定及命名得到了验证。比较基因组学分析揭示了硬骨鱼特有的 CCL32、CCL33、CCL34、CCL35、CCL36、CCL38、CCL39 和CCL44成员的存在,以及由硬骨鱼三次基因组复制(3R)而引起的CCL趋化因子数量的大量扩增。与其他模式物种CCL趋化因子相似,鲶鱼CCL趋化因子在染色体也呈现成簇分布的规律,主要的两簇分布在第7和第8条染色体上,分别包含18个和15个基因。CCL19、CCL34及CCL36的成员在爱德华氏菌和在柱状黄杆菌侵染后均呈现差异表达,且大部分差异表达基因呈现上调趋势;CCL19a.1、CCL19a.2及CCL19b均在易感染爱德华氏菌的鲶鱼中具极很高的表达量,揭示了 CCL19在鲶鱼免疫响应中发挥重要的重要作用。低氧胁迫后,不耐低氧的鲶鱼中差异表达基因CCL27a、CCL34a.1及CCL34a.2均显著上调,而耐低氧的鲶鱼中仅CCL36.4显著上调,其余三个差异表达基因显著下调。由此可见,与CXCL趋化因子亚家族相似,鲶鱼中某些CCL趋化因子的高表达与对病菌的易感和不耐低氧相关联。5.从鲶鱼基因组中鉴定出完整的CCR趋化因子受体及CXCR趋化因子受体,并研究其对低氧胁迫及细菌侵染的响应。我们从鲶鱼基因组及多个转录组中筛选出30个CCR趋化因子受体和8个CXCR趋化因子受体。以模式生物斑马鱼为参照,我们通过系统发生树分析,对这38个鲶鱼趋化因子受体基因进行了鉴定和命名。30个CCR趋化因子受体包含2个CCR6成员、1个CCR7成员、11个CCR8成员、2个CCR9成员、1个CCR10成员、11个CCR11成员、2个CCR12成员、1个CXCR1成员、1个CXCR2成员、3个CXCR3成员、2个CXCR4成员及1个CXCR5成员。共线性分析显示鲶鱼CCR和CXCR趋化因子受体所在染色体区域上下游的基因与斑马鱼对应区域基因分布结构保守,蛋白结构域分析显示这64个CCL趋化因子成员均含有保守的7TMGPCR结构域,因此这38个鲶鱼趋化因子受体基因的鉴定及命名得到了验证。比较基因组学分析揭示了硬骨鱼特有的CCR11及CCR12成员的存在,以及由硬骨鱼三次基因组复制(3R)而引起的CCR趋化因子数量的扩增。大部分差异表达的趋化因子受体基因在爱德华氏菌和在柱状黄杆菌侵染后均呈现上调趋势,其中CXCR3和CXCR4成员在两种细菌侵染过程中均有参与。此外,CXCR3.2和CXCR4b分别在爱德华氏菌侵染后的易感染鲶鱼和抗病鲶鱼中显著上调,揭示了 CXCR3和CXCR4在鲶鱼免疫响应中发挥重要的重要作用。低氧胁迫后,CCR9a和CXCR4b在耐低氧及不耐低氧的鲶鱼中均显著上调,且在耐低氧鲶鱼中表达量更高,揭示了 CCR9和CXCR4在鲶鱼耐低氧相应中的重要作用。此外,CXCR4b和CCR9a在低氧胁迫及细菌感染后均显著上升,可能解释了低氧胁迫和细菌入侵的某种联系。总之,鲶鱼趋化因子及趋化因子受体超家族的鉴定及对低氧胁迫和细菌感染的响应将为鱼类比较免疫学和生理学的研究提供宝贵的研究基础。