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植物microRNAs(miRNAs)是一类非编码的小RNA分子,长度为20～24个核苷酸,它可以在转录时或转录后通过切割靶mRNA或抑制mRNA翻译来调控基因表达。随着新一代高通量测序技术的发展,目前已发现的植物miRNAs共计超过2000种,但对其作用机制和生物功能的研究目前尚不透彻。研究表明,植物miRNAs不仅在植物的生长发育和生物应激反应等生命过程中发挥重要作用,而且外源性的植物miRNAs可由食物进入动物体内,并有可能对某些哺乳动物的靶基因进行调控。因而建立高灵敏度、高特异性的植物miRNAs分析方法对深入研究其生理功能以及对人类健康的影响尤为重要。miRNAs由于其序列短和含量低的特点,为分析方法的建立带来了一定的困难,而且大量的研究已经证实,植物miRNAs的结构与动物miRNAs存在较大差异,动物miRNAs序列3’末端碱基有2’-OH基团,而植物miRNAs序列3’末端碱基有2’-OCH3基团,受该基团空间位阻的影响,导致植物miRNAs的3’-OH末端难以发生碱基聚合反应,所以它不能直接用作引物进行聚合延伸,这极大地限制了多种核酸扩增方法的使用,也为植物miRNAs的检测带来了新的挑战。现在已建立的检测植物miRNAs的分析方法,主要有Northern印迹法,电化学法以及一些新型的核酸扩增方法。但这些方法都存在很多局限,因而构建简单灵敏的植物miRNAs检测方法,仍然具有非常重要的意义。虽然植物miRNAs不能用作引物进行聚合延伸反应,但其可作为优良模板介导核酸连接反应。在本论文中,我们利用植物miRNA为模板构建了高效率的点击核酸连接反应,建立了基于T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)转录结合恒温指数扩增反应(IEXPAR)的高灵敏分析方法,并将其应用于miR156a的检测。在该方法中,当目标分子miRNA存在时,两条分别修饰有N3和DBCO基团的探针会与其杂交,三者形成稳定的三明治式夹心杂交结构,并迅速发生点击核酸连接反应,使两条探针连接在一起。之后通过合理的设计,只有连接产物才能引发T7 RNAP转录并形成大量RNA序列,而转录形成的RNA可引发后续IEXPAR反应,实现对目标miRNA分子的快速定量检测。该方法克服了植物miRNAs无法直接作为引物来引发IEXPAR反应的缺点,同时还引入了热循环连接和T7 RNAP转录来实现对目标分子的信号放大。实验结果表明,该方法可以检测低至10 fM的miR156a,荧光响应与浓度的负对数有良好的线性关系,检测范围跨越四个数量级,而且有很好的特异性,可以实现单碱基区分。