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病毒受体是指存在于宿主细胞表面的,能够被病毒的吸附性蛋白识别并且与之结合,进而引起病毒感染动物的分子复合物。氨肽酶N(APN)是位于细胞表面的一种锌离子依赖的金属糖蛋向,是大多数Ⅰ型和Ⅱ型冠状病毒发生感染时的细胞受体。鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于Ⅲ型冠状病毒中的一种禽类冠状病毒,在进化上被认为是处于Ⅰ型和Ⅱ刑冠状病毒之间,目前IBV发生感染时的功能性细胞受体还没有完全被确定,在IBV的功能性细胞受体研究中,鸡氨肽酶N的研究最为广泛,目前IBV侵染的宿主大多限于禽类,因此更详细深入的探讨禽类APN是否是IBV感染的功能性受体是非常具有研究价值的。本实验从18日龄鸡的肾脏中提取了其总RNA,利用设计的分段引物采用RT-PCR方法对gAPN基因进行了分段克隆,然后利用SOE-PCR将各个片段连接构成了大小为2906bp的gAPN全长基因,将全长基因连接到原核表达载体pET30a (+)中构建原核表达质粒pET-gAPN,将其转化到E.Coli Rosetta中,诱导得到了大小为113kDa的重组蛋白,以重组蛋白pET-gAPN免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测多抗血清的效价高达215,以原核重组蛋白pET-gAPN和制备的多克隆抗血清进行、Vestern blot试验,结果此多抗能与pET-gAPN蛋白发生特异性反应。此外,从18日龄鸡肾组织分离到天然gAPN蛋向,Western blot检测发现多抗能与天然蛋白发生特异性结合。为了进一步检测多抗血清活性,将真核质粒pcDNA-gAPN转染到Hela细胞上,间接免疫荧光检测多抗血清与细胞上表达的蛋白有很好的反应性,说明制备的多克隆抗体具有良好的生物学活性。以表达的原核重组蛋白pET-gAPN为靶蛋白,利用噬菌体展示技术,以噬菌体十二肽库对gAPN蛋白进行四轮生物淘选,对竞争ELISA检测中阳性的单克隆进行核苷酸序列测定,推导出它们的多肽序列,选取同源性较好的两条多肽序列合成多肽HDYLYYTFTGNP (H)、 TKFSPPSFWYLH (T)。间接ELISA结果显示,所合成两种多肽具有与S蛋白多抗血清特异性结合的特性。病毒体外抑制实验表明H和T多肽对IBV在鸡胚肾细胞上的复制具有一定的抑制作用。用亲和多肽所对应的噬菌体培养物免疫鸡检测其体内抗病毒活性,结果表明多肽H、T免疫组鸡体内产生抗IBV S蛋白特异性抗体,且具有体外中和IBV的能力,荧光定量PCR检测证明免疫组雏鸡气管、肺脏和肾脏内IBV的含量有一定程度的减少,说明其有一定的抑制病毒在鸡体内繁殖的能力。本实验为进一步研究鸡APN是否能作为IBV感染的功能性受体提供了依据,也为研究开发相关的多肽疫苗提供了一些理论基础和研究依据。