研究背景1941年Huggins等的开拓性工作证明，经双侧睾丸切除后，80％患有转移性或局部晚期前列腺癌的病人，在生化检查及临床表现两方面均可获得明显的改善，其中10％的病人存活10年以上，另10％在6个月内死亡，大部分病人在经历18～24个月后，原来为激素依赖性前列腺癌(HDPC)，最终成为激素抵抗性前列腺癌(HRPC)。前列腺癌一旦发展到激素抵抗阶段是一个非常令人棘手的问题，尽管各国用大量的投入进行研究但收效甚微，目前临床上对HRPC没有特别有效的办法。要对HRPC的治疗有所突破，必须对其发病的分子机理进行深入的研究。细胞周期素依赖激酶抑制剂p27主要与cyclin结合而发挥对CDK2-cyclinE的抑制作用。p27对CDK的抑制作用有两方面，一方面p27能抑制已结合到cyclin上并被激活的CDK活性；另一方面p27也可以抑制CDK的激活过程，最终抑制细胞周期从G1期向S期的转变，故目前认为其是一个肿瘤抑制因子。在前列腺癌中，大多数数据显示随着前列腺癌分级和分期的提高，p27的表达呈进行性下降。在正常前列腺组织和激素依赖性前列腺癌细胞株中，p27表达在基线水平；但在激素抵抗性前列腺癌细胞株中，p27则失表达。研究发现：外源性恢复前列腺癌细胞株中p27基因的表达，可引起细胞周期被阻滞在G1期，并引起细胞凋亡增加。以上结果说明p27与前列腺癌进展、由激素依赖向激素抵抗转化存在联系，其可能成为治疗HRPC的理想靶点。EGFR在上皮、间质、神经源性组织中都有表达，其在调节正常细胞的增生、生长和分化中起着重要作用。研究表明：许多实体肿瘤有EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及凋亡的被抑制有关。其可能机制有：①EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；②突变型EGFR或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；③自分泌环的作用增强；④受体下调机制的破坏；⑤异常信号传导通路的激活等。对EGFR生成的检测有助于判断肿瘤预后，应用抗EGFR生成治疗可能会为肿瘤治疗带来进步。前列腺癌一般会出现几种生长因子和它们的受体过表达，其中包括EGF和EGFR。EGFR在前列腺癌的生长中起了十分重要的作用，在雄激素撤退过程中它使前列腺组织对EGF家族的生长促进作用变得十分敏感。EGFR信号级联和HRPC的发生之间的可能联系仍然在调查之中，但一些研究结果强烈显示二者存在密切联系。例如，EGFR在雄激素抵抗性前列腺癌细胞株中的表达明显比在雄激素依赖性前列腺癌细胞株中的表达强。旁分泌激活向自分泌激活转化可能导致肿瘤向雄激素独立转态进展。研究显示EGFR信号级联可以在缺乏雄激素的环境下激活雄激素受体。有研究结果显示EGF和其它生长因子可能激活选择性的信号级联，从而介导前列腺癌细胞的雄激素不依懒性生长。这些结果强烈暗示：抑制EGFR信号级联可能成为治疗HRPC的理想方法。随着前列腺癌进展、由激素依赖向激素抵抗状态转化过程中，p27的表达渐渐下降，但EGF及EGFR的表达却逐步升高，我们疑问这二者是否存在着一定联系呢?国内外文献尚无相关报道，我们拟对此问题做进一步探讨。第一部分人类p27基因全长读码框(ORF)真核表达载体构建【研究目的】为了使PC3细胞恢复p27基因的表达，对p27的功能进行较为全面的研究，我们构建了p27基因真核表达载体及其报告基因载体。利用这套载体可以使不表达p27基因的PC3细胞获得再表达，并可以对p27基因进行转染效率分析与定位。【材料与方法】PubMed查阅p27基因ORF序列，设计引物并合成。从人类正常前列腺组织内提取RNA，然后用RT-PCR方法扩增出全长p27基因，并将其克隆到T载体。并进一步以T载体为模板，把p27基因克隆到真核细胞高效表达的pcDNA3.1(-)载体。在构建此载体过程中，我们把HA-Tag片断连接在设计引物上，构建了带HA-Tag的p27基因。这样有利于我们进行鉴别外源性P27表达的和HA纯化。为了对p27基因进行定位研究与转染效率测定，我们把p27ORF构建到pEGFP-N1中。【结果】我们成功地构建了人类p27基因全长真核表达质粒载体及其报告基因质粒载体，构建后得到了测序证实。利用该套质粒系统，我们可以恢复PC3细胞p27基因的表达、进行p27基因定位分析、转染效率的检测和HA的标签纯化。从而可以对p27的功能进行较为全面的评价。【结论】(1)我们成功构建了p27基因真核表达质粒载体及其报告基因质粒载体；(2)该套质粒系统最大特点是给p27基因带上了像标签一样的HA-Tag，这样我们可以轻松鉴别实验中p27表达来自外源性还是细胞内在固有。这大大增加了本实验的科学性和严密性。第二部分p27在PC3细胞中的基本生物学功能的研究【研究目的】为了了解p27在PC3细胞中的基本生物学功能，我们进行了p27基因定位研究，并对P27影响PC3细胞的增殖、有丝分裂间期、凋亡细胞比例和凋亡相关蛋白的表达进行了深入的研究。【材料与方法】我们将pEGFP-p27用Lipofectamine 2000转染PC3细胞，转染后24小时收集细胞并用激光共聚焦方法对p27基因进行定位。用同样方法把pcDNA3.1-p27-HA-Tag转染至PC3细胞，在转染后24，48小时时间点收集细胞，用MTT方法检测细胞增殖；用PI染色流式细胞术检测细胞周期；用AV+PI双染法流式细胞术检测凋亡细胞比例；用western blot检测凋亡相关蛋白表达的变化。【结果】用激光共聚焦方法对p27基因进行定位研究时发现：pEGFP-p27转染组绿色荧光蛋白定位于细胞核，而对照的pEGFP转染组绿色荧光蛋白在细胞核和细胞浆均有，说明p27基因定位于细胞核。Western blot检测显示：在转染pcDNA3.1-p27-HA-Tag的PC3细胞中，p27呈高表达。转染pcDNA3.1-p27-HA-Tag后，细胞生长明显受到抑制，细胞周期被阻滞在G0／G1期，凋亡细胞比例明显增加。Western blot检测细胞凋亡蛋白的表达时发现：在pcDNA3.1-p27-HA-Tag转染组中，bcl-2表达下降、bax和bad表达上升、caspase-3被激活和PARP劈裂片断表达升高。【结论】(1) p27基因定位于细胞核；(2) p27基因真核表达质粒在PC3细胞中获得高表达；(3) p27抑制PC3细胞生长，使细胞周期被阻滞在G0／G1期，诱使PC3细胞凋亡增加；(4) p27基因转染组bcl-2表达下降、bax和bad表达升高、caspase-3激活和PARP劈裂片断表达增加。第三部分p27对EGFR及其信号途径影响的研究【研究目的】为了进一步研究p27抗肿瘤作用是否与EGFR的表达水平及其信号级联有关，我们对EGFR的表达、PI3K／Akt，NF-κB，PLCγ和Raf-1／MEK／MAPK信号级联进行了分析研究。【材料与方法】我们使用pcDNA3.1-p27-HA-Tag对PC3细胞进行瞬时转染，以空质粒pcDNA3.1转染组为对照。在转染后24，48小时时间点收集细胞并行蛋白裂解，用western blot分析EGFR的表达变化。同时我们为了进一步分析p27对EGFR信号级联的影响，还分析了PI3K(p85)、Akt和p-Akt(S473)的表达。同时还对NF-κB，PLCγ和Raf-1／MEK／MAPK信号级联进行了分析研究。蛋白表达变化用Kodark光密度分析软件进行定量。【结果】我们用western blot分析发现：在转染后24，48小时时间点，p27基因转染组与对照组相比，EGFR表达明显下降，表达抑制率在50％以上。在对PI3K／Akt信号级联进行分析时发现：PI3K(p85)表达量在p27基因转染组明显下降；尽管Akt表达变化不明显，但p-Akt(S473)表达明显下降。NF-κB，PLCγ和Raf-1／MEK／MAPK信号级联表达无明显改变。【结论】(1) p27明显抑制EGFR表达；(2) P27抑制PI3K(p85)和p-Akt(S473)表达；(3) p27抑制PC3细胞与抑制EGFR／PI3K／Akt信号级联有联系。