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端粒和端粒酶是现代分子生物学研究的热点之一,二者与哺乳动物细胞的衰老和人类肿瘤细胞的形成发展有着及其密切的关系。真核生物细胞的线性染色体末端覆盖着一段具有独特帽状结构的特殊DNA-蛋白质复合物,被称之为端粒,它的主要生物学功能:1.防止染色体末端被化学修饰或者核酸酶降解,2.阻止染色体末端出现端-端融合、重组或者染色体缺失现象,3.对维持DNA的正常复制与细胞增殖能力有重要作用。端粒长度伴随着正常细胞的每一次增殖分裂会逐渐缩短。细胞端粒长度缩短达到一定极限将造成细胞衰老和凋亡。因此,端粒被科学家们称为“生命时钟”。当端粒调节机制出现异常时,往往会引起肿瘤、自身免疫病等一系列疾病,而端粒酶与端粒保护蛋白就是调控端粒长度的影响因子。端粒酶是一种由蛋白质和RNA形成的核糖核蛋白的逆转录酶,直接以自身RNA为模板,合成末端的DNA序列,将其添加到端粒末端以维持端粒长度,阻止端粒长度随细胞分裂造成的缩短,它的存在解决染色体末端复制缩短问题,同时认为过度表达端粒酶活性与细胞的永生化和癌变是有一定直接关联。端粒结合蛋白分为两种:单链DNA结合蛋白和双链DNA结合蛋白,其中目前报道端粒保护蛋白1(POT1)是唯一的单链DNA结合蛋白,能够特异性地与端粒单链DNA结合;双链DNA结合蛋白是TRF1和TRF2,二者通过与TPP1和Tin2的相互作用,间接性地与POT1相互作用。端粒保护蛋白复合体由这5个蛋白与RAP1一起构成,附着在染色体末端,共同参与保护端粒和调节端粒长度。目前相关研究报道这6蛋白复合体的生物学功能主要有:1.参与端粒末端T-Loop的形成,2.形成端粒末端的保护结构,3.调节端粒酶活性来进一步影响端粒DNA合成及其端粒长度。这6个核心蛋白分别具有不同的生物功能,彼此之间的相互作用形成一个共同调控端粒结构和功能的复杂端粒蛋白网络。本文就TPP1蛋白对端粒单链结合蛋白POT1的功能调控,以及对TRF2定位的影响做了以下研究:我们首先构建融合蛋白POT1-TPP1-C100,并通过免疫共沉淀实验证实沉默内源蛋白TPP1表达后该融合蛋白中的POT1能够在TPP1-C100的介导下与Tin2相互作用。我们将该融合蛋白在肿瘤细胞HepG2中稳定表达,通过免疫荧光(IF)和免疫荧光原位杂交(IF-FISH)实验表明TPP1siRNA抑制内源TPP1表达后POT1在融合蛋白TPP1-C100介导下能够定位在端粒末端。我们成功构建克隆POT1-TPP1-C100能够在细胞内稳定表达相应蛋白,并且抑制内源性TPP1蛋白表达后,POT1在TPP1-C100的介导下可以进入细胞核,并且定位在端粒末端。研究报道POT1可以通过阻止RPA与端粒结合来抑制依赖ATR信号通路的端粒DNA损伤反应(DDR)。免疫荧光观察高表达POT1-TPP1-C100肿瘤细胞HepG2的53PB1活化情况。结果显示,抑制内源TPP1表达后,尽管POT1仍定位在端粒末端,但仍有大量53BP1在端粒上形成TIFs。我们又用Western Blot检测沉默内源TPP1的表达后在POT1-TPP1-C100的稳定克隆中另一个端粒DNA损伤标志蛋白β_H2AX活化量。结果γ_H2AX活化水平明显增高;分别用ATM和ATR的siRNA处理沉默ATM和ATR的表达后,γ_H2AX的活化量有明显的下调,表明抑制TPP1表达诱导的端粒DNA损伤是同时依赖于ATM和ATR途径。实验表明TPP1对POT1功能调控除了涉及到POT1入核、入核后的端粒定位外,还参与了 POT1最终发挥抑制ATR介导的端粒DNA损伤反应的功能等多个过程;TPP1对维持端粒蛋白复合体(Shelterin)的稳定性,并最终发挥端粒保护作用是不可或缺的一个组合元件。TRF2蛋白保护端粒的正常功能,维持端粒形态和结构完整性,抑制ATM激酶活性。当TRF2缺失或者其活性被抑制或失活就会造成端粒功能障碍,形成DNA损伤灶,出现DNA损伤因子(如53BP1、RAD17和β_H2AX等)聚集现象。我们在免疫荧光实验过程中发现抑制内源TPP1表达后,对照组的肿瘤细胞HepG2和高表达外源蛋白POT1的细胞中的TRF2并没有定位于端粒,而是弥散的核仁分布;并且在相关Western Blot检测中也观察到TPP1抑制后会出现依赖ATM信号通路的端粒DNA损伤途径。在肿瘤细胞HepG2中分别敲除内源POT1、TRF1、TPP1、Tin2后,免疫荧光观察发现TPP1和Tin2沉默表达后能够很明显下调TRF2的端粒定位,而其他两个蛋白几乎没有存在影响。我们又分别在高表达外源蛋白TPP1和Tin2的肿瘤细胞中分别敲除TPP1和Tin2,发现高表达外源蛋白TPP1的细胞中沉默Tin2表达后,TRF2的端粒定位一样受到下调影响,而沉默TPP1表达对其是没有多大影响;高表达外源蛋白Tin2的细胞中沉默Tin2和TPP1蛋白对TRF2的定位没有影响。研究表明TPP1蛋白影响TRF2端粒定位,并且是通过Tin2连接蛋白来间接调控的。而在高表达外源蛋白POT1-TPP1-C100的肿瘤细胞中,我们前期实验证实沉默内源TPP1表达后TRF2仍然可以端粒定位。为此我们将小片段TPP1-C100在肿瘤细胞HepG2中高表达后观察沉默内源TPP1表达后对TRF2的影响,实验结果表明单独的TPP1-C100能够有效介导TRF2的端粒定位。总结:1、单独的POT1端粒定位不能有效抑制依赖ATR信号途径的端粒DNA损伤反应,必须与TPP1相互作用形成二聚体形式共同发挥抑制作用。2、TPP1能够通过Tin2间接地调控TRF2的端粒定位,并且这个调控区域在与Tin2相互作用的TPP1的C末端。以上研究结果对进一步阐明TPP1对端粒的保护机制及其在肿瘤研究中的生物学意义奠定了基础。