目的：肺癌是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤，其中约85％为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)，严重危害国民健康。大多数NSCLC患者在确诊时已为晚期，失去了最有效的手术治疗机会，而内科治疗中各种化疗方案的客观反应率仅为25%左右且毒副反应大。近年来，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinaseinhibitors，TKI）在晚期NSCLC的一线治疗中获得巨大成功，对EGFR突变患者的有效率达到了62%-83%，显著延长了患者的生存时间，但几乎所有接受EGFR-TKI治疗的患者会相继出现耐药，EGFR-TKI继发性耐药成为靶向药物临床应用的一大瓶颈和关键难题，因此，阐明 EGFR-TKI的耐药机制是肺癌治疗中亟待解决的问题。目前已有学者对于EGFR-TKI继发性耐药进行了很有价值的研究：EGFR基因第20外显子继发突变、下游效应分子的结构性活化、EMT、cMET基因扩增、血管生成增加及肿瘤微环境参与耐药，此外还包括PIK3CA突变、AXL激酶活化等。然而遗憾的是，上述研究仅能解释部分NSCLC继发性EGFR-TKI耐药问题。新近研究发现，氯喹处理的结肠癌细胞株自噬效应减弱，伴有UPS标志酶活性增强，蛋白酶体亚基（ Proteasome Subunit，PS）mRNA表达增高，且细胞出现化疗耐药，证实泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome System，UPS)调控自噬效应在肿瘤耐药中也起到重要的作用，但确切机制仍不清楚。前期研究显示：EGFR-TKI继发性耐药细胞株中PSMC2的表达与敏感株比较明显增高，连续荧光检测耐药株细胞糜蛋白酶样(chymotrypsin-like，CT-L，UPS标志物之一)的活性增强，western blot检测自噬体标记蛋白LC3、Beclin水平下调，同时EGFR下游效应蛋白Akt表达降低。应用RNAi抑制耐药细胞中PSMC2的表达后，胞内UPS活性降低，自噬水平升高，细胞对EGFR-TKI的敏感性增加，提示我们PSMC2可能通过激活UPS调控自噬效应，在肺癌EGFR-TKI继发性耐药中发挥关键作用。深入研究PSMC2探讨PSMC2亚基通过UPS调控自噬效应在非小细胞肺癌EGFR-TKI继发性耐药中的作用及机制。　　方法：EGFR在结构上是一种跨膜蛋白，它是细胞表皮生长因子(Erb)受体家族成员，其结构包括三个区域：分别是胞外配体结合区、胞内酪氨酸激酶活性区及位于二者之间的跨膜区。其中胞外配体结合区中最主要结合区域当属294至543位的氨基酸。胞内酪氨酸激酶活性区据其结构功能不同又可划分为三个亚区，分别为近膜、酪氨酸激酶及碳端亚区，其中起关键作用的酪氨酸激酶亚区具有ATP的结合位点，EGFR-TKI可以竞争性地与其结合，结合后发生的占位效应可以阻断通常情况下由配体与受体结合而触发的后续信号转导。临床研究发现酪氨酸激酶区主要的突变区域集中在18-21外显子区，突变主要包括：21exon点突变(L858R)，几率约占40-45%；19exon的缺失突变(delE746-A750)，其发生几率与前者相当；另外还发现了18exon点突变(G791X)，占几率很少，约为5%；20外显子突变，几率也不大，约为5%左右，主要为插入突变。在所检测到的EGFR的这些突变中，常见的21exon的L858R点突变，会激活酪氨酸激酶（TKI）并使其长期处于活化状态，19exon突变发生区域主要是在ATP与EGFR结合的区域，此突变会造成其自身的ATP结合位点结构发生改变；而exon18的G791X突变会使EGFR构象发生失稳定化，EGFR也会被激活并且是被持续激活，EGFR-TKI的作用机制是它与EGFR的ATP结合位点结合，并且这种结合早于ATP，这样的结合不但不会激活下游信号通路，并且会阻断信号的传导，这样细胞生长方面的信号就会中断，达到了控制肿瘤生长的目的。上述EGFR的几种突变都是EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌的适应症。并且既往研究已经证实，EGFR-TKI类药物对有上述EGFR突变病人的治疗有效率高达75%左右。由此看来，为提高治疗有效率，临床在采用TKI类药物治疗NSCLC前，应该检测患者是否存在上述EGFR突变。对于临床检测到存在上述EGFR突变的临床晚期不能手术的非小细胞肺癌患者，EGFR-TKI是目前治疗的优先选择，常用的是作用于EGFR胞内区的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，代表药物为吉非替尼（gefitinib）、厄洛替尼，这类药物低毒、高效、患者依从性好，但用药治疗一段时间后，患者不可避免会产生耐药，既有原发性耐药，也有继发性耐药，后者也被称为获得性耐药。目前NSCLC继发性EGFR-TKI耐药的具体机制仍有待深入研究，PSMC2激活UPS抑制自噬效应引起的EGFR-TKI耐药的具体作用及机制尚未见研究。前期研究发现PSMC2在EGFR-TKI继发性耐药肺癌细胞中高表达并激活UPS，抑制胞内自噬效应。在此基础上，我们从下述4个方面综合探讨PSMC2通过UPS调控自噬效应在EGFR-TKI耐药过程中的具体作用及机制：　　1.耐药NSCLC细胞株模型中PSMC2表达及UPS活性、自噬效应的变化　　我们首先成功建立了前期实验使用的Gefitinib继发性耐药细胞株PC9/R。通过检测 PC9/R细胞株模型中 PSMC2的表达，同时检测 UPS相关指标（糜蛋白酶样(chymotrypsin-like,CT-L)、肽基谷氨酰肽水解酶样(peptidly-glutamyl peptide-hydrolyzing-like,PGPH-L)、胰蛋白酶样(trypsin-like,T-L)）的蛋白酶体活性；EGFR、自噬调控PI3K-Akt-mTOR通路关键因子（ PI3K、p-PI3K、Akt、 mTOR、p70s6、 eIF4E等)的表达；自噬标志物（ Atg5、 Beclin1、 LC3-II）的变化。UPS具有3种主要的蛋白酶活性，分别是CT-L、 PGPH-L和T-L活性，这3种酶活性代表了UPS的活性，是维持细胞动态平衡所必需的。PI3K、 p-PI3K、Akt、 mTOR、 p70s6、eIF4E是自噬的和EGFR关键调控信号和下游效应因子； Atg5、 Beclin1、 LC3-II是自噬体形成的标志物。PSMC2与它们的关系决定了其在该过程中的重要作用和意义。分析PSMC2在EGFR-TKI耐药过程中参与上述UPS、自噬、TKI耐药之间各因子的调节作用及其方向。　　2. PC9/R细胞中PSMC2介导的信号传导通路及各环节间的交互作用　　UPS是胞内蛋白质选择性降解的一条重要途径，PI3K/Akt/mTOR途径是自噬效应的重要信号通路，但目前尚不知PC9/R细胞中PSMC2如何通过上述通路传导信号。前期研究从UPS相关蛋白酶活性、PSMC2、自噬效应三个层面，采用功能失活（ loss-of-function）、功能激活（ gain-of-function）靶向基因和特异性抑制剂、激活剂等方法，干扰或过表达上述通路信号分子后，检测各环节分子的表达变化，明确EGFR-TKI耐药的PC9/R细胞中PSMC2与UPS、自噬信号途径的关系和交互作用，同时分别检测UPS相关指标（ CT-L、 PGPH-L和 T-L活性）； EGFR、自噬调控PI3K/Akt/mTOR通路关键因子（PI3K、 p-PI3K、 Akt、 mTOR、 p70s6、 eIF4E)；自噬标志物（Atg5、Beclin1、LC3-II）的变化，分析各途径在EGFR-TKI耐药中的主要作用。　　3.PSMC2在裸鼠耐药模型中的表达及UPS、自噬与TKI耐药的表达关系　　首先从基因及蛋白水平分析PSMC2的表达，同时检测UPS、EGFR、自噬通路相关分子的表达变化，分析耐药肿瘤模型表达的PSMC2在EGFR-TKI耐药中的作用。然后分别使用PSMC2的功能失活（loss-of-function）、功能激活（ gain-of-function）基因处理模型动物，观察PSMC2表达变化对UPS、 EGFR、自噬、 EGFR-TKI耐药的影响，探讨PSMC2作为逆转耐药靶点的作用。　　本研究前期通过EGFR-TKI耐药细胞PC9/R、裸鼠肿瘤模型，采用RNA干扰、qPCR、Western blot、流式、激光共聚焦显微镜等手段，从分子、细胞、组织以及动物水平等层次明确了PSMC2通过UPS调控自噬效应在EGFR-TKI耐药中的作用，探讨了PSMC2在EGFR-TKI耐药过程中的调控信号通路与分子机制，确定了PSMC2与UPS、自噬效应的关系。本研究主要收集临床标本对前期工作进行验证，收集EGFR-TKI耐药和敏感肺癌临床样本各49例，结合临床病理资料，分别从基因及蛋白水平检测PSMC2的表达、自噬调控通路PI3K/Akt/mTOR关键因子mTOR、自噬标志物Beclin1的表达，明确PSMC2与UPS、自噬在EGFR-TKI耐药中的关系和交互作用。　　结果：免疫组化检测49例耐药标本中PSMC2、mTOR和Beclin1表达阳性率分别为73.50%、77.60%和24.49%；敏感标本中表达阳性率分别为18.37%、14.49%和83.67%。RT-PCR检测结果显示：敏感组患者PSMC2、mTOR mRNA和蛋白表达水平均低于耐药组，而Beclin1的结果正好相反，敏感组高于耐药组。Western blot检测结果显示， EGFR-TKI耐药组肿瘤组织中Beclin-1和LC3阳性表达水平明显低于EGFR-TKI敏感组（0.315±0.037比1.226±0.017和0.420±0.016比1.023±0.014），mTOR阳性表达水平明显高于EGFR-TKI敏感组（0.986±0.032比0.282±0.021），差异有统计学意义（P＜0.05）。PSMC2和Beclin1的表达在敏感组和耐药组均呈负相关，mTOR和PSMC2的表达在敏感组和耐药组均呈正相关，mTOR与Beclin1的表达则呈负相关。　　结论：EGFR-TKI继发性耐药成为靶向药物临床应用的一大瓶颈和关键难题，目前有关靶向耐药机制方面研究很多，其中自噬就是调控肿瘤细胞耐药的重要因素，但有关UPS在这方面的作用的研究却很少，PMSC2是UPS调节颗粒的一个亚基，在EGFR-TKI继发性耐药中表达明显升高，相反，自噬标记基因和蛋白表达却下降，PMSC2有可能通过UPS调控自噬诱发EGFR-TKI继发性耐药，这可能只是肺癌EGFR-TKI继发性耐药机制的一部分，可以帮助我们寻找预测耐药潜在的分子标志物，而且为逆转肺癌耐药和个体化治疗提供重要的靶点。　　PMSC2如何通过UPS调控自噬诱发EGFR-TKI继发性耐药，有哪些调控因子和通路参与其中以及它们之间互相制约和协作的关系，有待于我们进一步深入研究。