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目的:建立虚瘀型肺癌复合模型,观察大黄?虫丸对虚瘀型肺癌模型小鼠免疫功能的影响。方法:1、分组:SPF级健康雌性C57BL/6J小鼠46只,按照随机数字表法分为5组,正常组(A组)、模型组(B组)、大黄?虫丸组(C组)、顺铂组(D组)、大黄?虫丸和顺铂联合用药组/联合组(E组),A组6只,B组、C组、D组、E组各10只;于造模前测体重,观察精神状态、活动情况、饮食饮水量、毛色及二便等情况。2、造模及给药:(1)虚瘀小鼠模型的制备:所有动物适应性饲养7天,除正常组外,其余四组动物采用环磷酰胺腹腔注射80mg/kg剂量,连续注射3天,之后每周加强一次;并给予每天冷水游泳(水温4-6℃,4min),造模时间为30天。正常组在同期给药时间给予同等剂量的生理盐水腹腔注射。(2)虚瘀型肺癌小鼠模型的制备:第31天将收集培养好的Lewis肺癌细胞,细胞计数后,用生理盐水稀释,调整细胞浓度为1×10~7/ml,于小鼠右腋部皮下注射0.2ml/只,连续10天。(3)药物干预:给药依据人和鼠给药剂量换算公式,计算出大黄?虫丸按1.802g/kg/d给药,顺铂注射液按lmg/kg给药。各组均在Lewis肺癌细胞接种第6天晨起空腹开始给药。大黄?虫丸组灌服大黄?虫丸混悬液,每天1次,每次0.4ml,连续21d;顺铂组给予顺铂注射液腹腔注射(i.P.),第4、11、18天各1次,每只小鼠注射0.2ml;联合组灌服大黄?虫丸混悬液(每天,连续21天),隔两个小时后DDP腹腔注射(第4、11、18天各一次);空白组与模型组灌胃按等容积给予生理盐水,灌胃量0.4ml,每天l次,连续21d。观察指标:(1)一般情况:每日定时观察并记录各组小鼠的精神状态、活动、毛色以及进食饮水量、体重等一般情况。(2)形态学改变:采用HE染色,于光镜下观察不同组别下小鼠肿瘤组织的病理形态学改变。(3)体重变化、死亡率、肿瘤质量、脾脏指数;(4)免疫指标:小鼠血清IL-2含量(ELISA法检测);脾细胞CD4~+、CD25~+、CD25~+Foxp3~+Treg含量(流式细胞术检测)。结果:(1)一般情况:与正常组相比,其它各组小鼠的精神状况、活动、毛色、进食饮水量以及体重等,均发生了不同程度的改变,表现出一系列的病理特征。实验期间,小鼠在接受内外混合刺激后出现精神萎靡,身体蜷缩,扎堆,活动减少,饮食进水量减少以及体重增长缓慢甚至降低等症状。(2)形态学观察:经HE染色,在电镜下观察各组小鼠肿瘤组织的病理学变化,可见,与模型组相比,大黄?虫丸组、顺铂组、联合组的肿瘤病理间质中血管成分均明显减少;肿瘤组织内有细胞核固缩,大片细胞崩解的碎片及坏死。(3)小鼠体质量变化、死亡率、肿瘤体质量、脾脏指数:小鼠体质量变化:用药前,与正常组比较,模型组、大黄?虫丸组、顺铂组有显著差异(P<0.01),与模型组比较,大黄?虫丸组、顺铂组无统计学差异(P>0.05)。用药后,与正常组比较,大黄?虫丸组、顺铂组有显著差异(P<0.01),与模型组比较,大黄?虫丸组、顺铂组、联合组小鼠体质量差异不显著(P>0.05)。各组小鼠用药后与用药前体质量差值不显著(P>0.05)。死亡率比较:模型组>联合组>大黄?虫丸组、顺铂组。肿瘤体质量:除正常组外,其余四个组小鼠腋下肿瘤明显增大。与模型组比较,大黄?虫丸组、顺铂组、联合组肿瘤重量差异显著(P<0.01);与大黄?虫丸组比较,联合组有显著统计学差异(P<0.05);与顺铂组比较,联合组有显著统计学差异(P<0.01)。大黄?虫丸组肿瘤重量与顺铂组比差异不显著(P>0.05)。脾脏指数:与正常组比较,模型组、大黄?虫丸组、顺铂组有显著统计学差异(P<0.01),联合组有统计学差异(P<0.05);其余组间无统计学差异(P>0.05)。(4)免疫指标:小鼠血清IL-2含量:与正常组比较,顺铂组有显著统计学差异(P<0.01);与模型组比较,顺铂组有显著统计学差异(P<0.01);与大黄?虫丸组比较,顺铂组、联合组有显著统计学差异(P<0.01);顺铂组与联合组无显著差异(P>0.05);脾细胞CD4~+、CD25~+、CD25~+Foxp3~+含量:CD4~+:与正常组比较,模型组CD4~+明显高于正常组(P<0.01),大黄?虫丸组比正常组高(P<0.05);与模型组比较,顺铂组CD4~+低于模型组,有显著统计学差异(P<0.01),联合组CD4~+值低于模型组,有统计学差异(P<0.05);与大黄?虫丸组比较,顺铂组CD4~+值低于大黄?虫丸组,有统计学差异(P<0.05);顺铂组与联合组无统计学差异(P>0.05)。CD25~+:与正常组比较,模型组、大黄?虫丸组CD25~+高于正常组(P<0.01);与模型组比较,顺铂组、联合组CD25~+均低于模型组(P<0.01);与大黄?虫丸组比较,联合组CD25+值低于大黄?虫丸组(P<0.01);顺铂组与联合组比较无统计学差异(P>0.05)。CD25~+Foxp3~+:与正常组比较,大黄?虫丸组、顺铂组、联合组脾组织中CD25~+Foxp3~+均高于正常组,有显著统计学差异(P<0.01);与模型组比较,大黄?虫丸组、顺铂组、联合组脾组织中CD25~+Foxp3~+值均低于模型组(P<0.01);大黄?虫丸组、顺铂组、联合组组间比较,差异不显著(P>0.05)。结论:(1)采用多因素(虚-腹腔注射环磷酰胺、瘀-寒冷刺激、肿瘤-Lewis肺癌细胞接种)进行造模,符合临床肿瘤的形成因素。(2)大黄?虫丸对虚瘀型肺癌小鼠的一般情况(精神状态、活动、皮肤毛色、进食量、饮水量、体重)、肿瘤质量、脾脏指数、肿瘤病理形态以及免疫指标(血清IL-2;脾细胞CD4~+、CD25~+、Foxp3~+Treg)均有不同程度的改善及免疫调节作用。(3)实验显示,大黄?虫丸通过上调小鼠免疫指标血清IL-2表达,降低脾细胞CD4~+、CD25~+、CD25~+Foxp3~+的含量调节免疫状态,达到抑制肿瘤增长。