T细胞的活化与分化需要抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs)的辅助。T细胞必须接受APCs提供的三种信号才能有效活化与分化:第一信号是APCs表面的MHC-抗原肽与T细胞表面的TCR结合决定T细胞识别抗原的特异性;第二信号是APCs表面的CD80/CD86与T细胞表面的CD28结合提供协同刺激信号保证抗原特异性T细胞能够充分扩增;第三信号是APCs分泌的细胞因子作用于T细胞决定抗原特异性T细胞的分化方向。树突状细胞(dendritice cell, DC)是目前发现的功能最强大的APCs,也是唯一能够激活初始T细胞的专职APCs。研究认为初始T细胞分化成具有不同功能的抗原特异性T细胞的过程受DC所调控,DC的性质和功能状态直接影响T细胞的活化和分化方向。调节DC的功能将有可能对T细胞介导的疾病产生不同的影响。胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是一种典型的脑肠肽,在体内存在多种活性形式,包括4、8、33、39和58肽等,其中硫酸化的八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide, CCK-8)是最主要的活性形式。CCK-8通过细胞表面的CCK受体(CCK-receptor, CCKR)在中枢和外周神经系统发挥多种调节功能。我们先前的系列研究表明CCK-8通过其表达于效应细胞表面的受体发挥抗炎和免疫调节功能。CCK-8能够抑制LPS诱导巨噬细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子,促进抗炎细胞因子IL-10的分泌;并能抑制活化的巨噬细胞表面CD80和CD86的表达,降低其抗原提呈时的协同刺激功能。此外,CCK-8对LPS诱导的B细胞表面协同刺激分子表达和细胞因子分泌有调节作用。我们的最新研究表明DC表面也表达CCKR,CCK-8通过与DC表面的CCKR作用调节MAPK-NF-κB信号通路,上调DC分泌IL-12。因此我们推测CCK-8可能会对DC细胞表型和细胞因子分泌发挥调节作用,进而调节T细胞活化与分化,并对T细胞介导的疾病产生影响。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性侵蚀性周围关节炎为主要表现的自身免疫病。虽然其确切发病机制尚不完全清楚,但多数学者认为RA是在遗传和环境因素作用下由T淋巴细胞介导的自身免疫病,CD4+T细胞的分化异常和功能紊乱是其发病的重要原因。传统认为RA是Th1细胞占优势的疾病。然而,清除或中和Th1型细胞因子IFN-γ或IL-12,不能预防或减轻疾病进程。随后的研究发现IL-17在RA发病中有重要作用,IL-17可刺激单核细胞、巨噬细胞和滑膜细胞产生促炎细胞因子促进炎症反应,软骨破坏及血管翳形成。动物实验证实缺失分泌IL-17的T细胞可以使RA的发病受到抑制。因此,目前众多学者认为Th17细胞及其产生的IL-17是类风湿性关节炎发病的关键因素,抑制Th17细胞反应可能有利于RA病情缓解。基于上述理论和研究结果,我们推测CCK-8有可能通过调节DC表型和细胞因子分泌来调控CD4+T细胞的活化与分化,并进一步对RA的发病和转归产生影响。据此,本课题在体外细胞实验和疾病实验动物模型整体水平系统分析了CCK-8对DC功能的影响及其对CD4+T细胞活化与分化的调节作用,并进一步观察了CCK-8对RA实验动物模型-胶原诱导型小鼠关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)发病和关节病变的影响。1 CCK-8体外作用DC对抗原特异性T细胞分化的影响目的:DC活化过程中表达的协同刺激分子水平和分泌的细胞因子类型影响T细胞的活化和分化方向。调节DC成熟过程中的表面分子表达和细胞因子分泌将会对T细胞介导的免疫反应产生不同的影响。本部分研究主要采用体外细胞实验观察CCK-8对LPS诱导DC成熟过程中细胞表型和功能的影响,及其对抗原特异性CD4+T细胞增殖和分化的调节作用。方法:骨髓细胞自DBA/1J小鼠股骨和胫骨骨髓中分离,在含有GM-CSF的完全培养基中培养6~7天,收集悬浮和疏松贴壁细胞,作为骨髓来源的DC(bone marrow-derived dendritic cell,BM-DC)使用。(1)将BM-DC分为五组: Medium组(只加培养基) ; LPS组(1μg/ml) ;LPS(1μg/ml)+CCK-8(10-6、10-8、10-10 mol/L)。将细胞按上述条件培养24h,收集细胞,分别同时加入PE-抗CD11c抗体和FITC-抗CD80、FITC-抗CD86或FITC-抗MHCII抗体,孵育30min,采用流式细胞仪进行检测。分析CD11c+细胞表面CD80、CD86和MHCII表达量的变化。(2)用CD11c+免疫磁珠分选BM-DC获得纯化的DC(purified BM-DC,pBM-DC),将pBM-DC分为五组: Medium组(只加培养基) ; LPS组(1μg/ml) ;LPS(1μg/ml)+CCK-8(10-6、10-8、10-10 mol/L)。将细胞按上述条件培养24h。①收集上清,ELISA法检测IL-23含量;②收集细胞,用50μg/ml丝裂霉素C(mitomycin-C, MMC) 37°C孵育1h后,与免疫磁珠分选的CII特异性CD4+T细胞共培养,采用MTS法测定T细胞增殖,采用ELISA法检测培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β含量。结果:(1)未经LPS诱导的未成熟BM-DC表达较低水平的CD80、CD86和MHCII,经LPS诱导的成熟BM-DC CD80、CD86和MHCII表达显著增高,一定浓度的CCK-8与LPS同时作用则显著抑制了BM-DC CD80、CD86和MHCII表达,提示CCK-8可抑制LPS诱导BM-DC表型成熟。(2)未成熟pBM-DC分泌IL-23的能力非常低,低于试剂盒检测的下限。经LPS诱导的成熟pBM-DC分泌IL-23的水平明显升高,10-6和10-8 mol/L CCK-8处理则显著抑制LPS诱导的IL-23分泌(P<0.05),10-10 mol/L CCK-8处理作用效果不明显。(3) LPS诱导的成熟pBM-DC作为APC能显著刺激抗原特异性CD4+T细胞增殖,不同浓度CCK-8与LPS同时作用pBM-DC后则明显降低pBM-DC的刺激能力,CD4+T细胞的增殖活性下降(P<0.05)。(4)与未成熟pBM-DC相比,LPS诱导的成熟pBM-DC可刺激CD4+T细胞产生高水平IFN-γ和IL-17,一定浓度的CCK-8与LPS共同作用pBM-DC与LPS组相比显著提高IFN-γ的水平(P<0.05),降低IL-17的产生(P<0.05),不同浓度CCK-8与LPS同时作用pBM-DC对CD4+T细胞产生IL-4和TGF-β的水平无明显影响(P>0.05)。我们先前的研究结果发现,LPS刺激DC成熟可显著促进DC分泌IL-6、IL-1β、IL-12和TNF-α;CCK-8处理则明显降低IL-6、IL-1β和TNF-α的产生,促进IL-12的产生。综合分析这些实验结果,提示CCK-8通过调节DC成熟过程中的细胞表型和细胞因子分泌对抗原特异性CD4+T细胞的增殖和分化发挥调节作用,通过上调IL-12的产生促进Th1细胞分化,下调IL-6和IL-23的产生抑制Th17细胞分化和扩增。2 CCK-8体内作用对DC功能及T细胞分化的影响目的:第一部分体外细胞实验证实,CCK-8通过调节DC成熟过程中的细胞表型和细胞因子分泌对抗原特异性CD4+T细胞的增殖和分化发挥调节作用。本部分研究我们将在疾病实验动物模型整体水平观察CCK-8对DC和CD4+T细胞的调节作用。方法:采用鸡CII加弗氏完全佐剂的乳化液免疫RA易感动物DBA/1J小鼠,建立CIA模型。小鼠随机分为四组:生理盐水对照组;CCK-8 1nmol组;CCK-8 5nmol组;CCK-8 10nmol组。各组小鼠于第二次增强免疫同时,腹腔注射以上药物,每天注射1次,连续注射7天。于第一次免疫后28天,取各组小鼠腹股沟引流淋巴结:(1)采用流式细胞双标术检测CD11c+细胞表面CD80、CD86和MHCII表达。(2)提取总RNA,采用荧光定量RT-PCR法检测IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19、IL-6、T-bet(T-box expressed in T cells)、Gata-3(GATA binding protein 3)、RORγt(orphan nuclear receptor gammat)、Foxp3(foxhead/winged-helix box protein 3)、IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-βmRNA表达。(3)免疫磁珠分选CD4+T细胞,经CII刺激,MTS法检测细胞增殖,ELISA法检测培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β的含量。结果:(1) 1nmol CCK-8处理对CIA小鼠腹股沟引流淋巴结DC表面CD80、CD86和MHCII表达无明显影响(P>0.05);5nmol和10nmol CCK-8处理可显著降低DC表面CD80、CD86和MHCII的表达量(P<0.05或P <0.01)。这一结果提示,一定浓度的CCK-8在实验动物整体水平对DC的表型成熟同样具有抑制作用。(2) 1nmol CCK-8处理对小鼠腹股沟引流淋巴结IL-12p35、IL-12p40、IL-6和IL-23p19 mRNA表达无明显影响(P >0.05); 5nmol CCK-8处理可显著提高IL-12p35和p40 mRNA表达(P <0.05)而抑制IL-6和IL-23p19 mRNA表达(P<0.01);10nmol CCK-8处理对IL-12p35和p40 mRNA表达无明显影响(P >0.05),但是可显著抑制IL-6和IL-23p19 mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。IL-12、IL-6和IL-23主要由APC(主要包括DC和单核巨噬细胞)分泌,结合第一部分CCK-8体外作用对DC分泌细胞因子的影响,提示一定浓度CCK-8在实验动物整体水平对DC分泌的细胞因子同样具有调节作用。(3) 1nmol CCK-8处理对小鼠腹股沟引流淋巴结中T-bet、Gata-3、RORγt、Foxp3、IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-βmRNA表达均无明显影响(P>0.05)。5和10nmol CCK-8处理可显著提高T-bet、Foxp3、IFN-γ、IL-4和TGF-βmRNA表达(P<0.05或P<0.01),抑制RORγt、IL-17 mRNA表达(P<0.05或P<0.01),对Gata-3 mRNA表达无明显影响(P>0.05)。(4)对照组小鼠CD4+T细胞经CII刺激后体外明显增殖,并能产生较高水平的IL-17和较低水平的IFN-γ和TGF-β,而CCK-8处理组小鼠CD4+T细胞的增殖活性明显下降(P<0.05),并且显著抑制IL-17的分泌促进IFN-γ和TGF-β的产生(P<0.05),而对IL-4的产生无明显影响(P>0.05)。以上结果表明:CCK-8腹腔注射CIA小鼠能够下调DC表面CD80、CD86和MHCII表达,并通过抑制IL-6和IL-23的产生,促进IL-12的产生,抑制CD4+T细胞向Th17细胞分化,促进其向Th1和Treg细胞分化。3 CCK-8对CIA发病和关节病变的影响目的:目前研究表明Th17细胞通过分泌IL-17在RA发病中发挥关键作用。本课题前两部分体内外实验证实,CCK-8通过调节DC细胞表型和细胞因子分泌对抗原特异性CD4+T细胞的活化和分化发挥调节作用,尤其是抑制抗原特异性Th17细胞反应,提示CCK-8可能会延缓或防止RA发病。因此,本部分实验我们建立CIA模型,观察CCK-8对RA发病的影响。方法:CIA模型的建立及分组处理同第二部分。于第二次增强免疫同时,隔日对小鼠发病率及关节肿胀程度进行观测。于第一次免疫后35天,(1)取小鼠后肢踝关节观察组织病理改变;(2)取小鼠后肢踝关节提取组织蛋白,检测各种炎性细胞因子和调节因子水平;(3)留取小鼠血清检测抗CII特异性抗体及其亚型水平。此外,分离CIA小鼠膝关节滑膜组织细胞,在CII刺激下,与不同浓度CCK-8共培养,检测培养上清中各种炎性细胞因子的含量。结果:(1) 5和10nmol CCK-8于小鼠腹腔注射一周,能显著延迟CIA发病、降低发病率、减轻疾病严重程度,而1nmol CCK-8作用效果不明显。因5和10nmol CCK-8腹腔注射对CIA关节评分的影响无显著差异,因此后续实验均以5nmol剂量进行。(2)组织病理学观察结果显示:正常小鼠关节结构完整,无炎性细胞浸润,滑膜细胞排列整齐,软骨表面光滑,关节腔内未见渗出液;CIA对照组小鼠关节局部可见大量的炎细胞浸润,滑膜组织增生,关节软骨和骨组织破坏,关节腔内可见大量的炎性渗出液;CCK-8处理组小鼠关节局部炎症反应明显减轻仅显示轻度的滑膜组织增生和炎细胞浸润。组织病理评分结果显示CCK-8处理组组织病理评分显著低于对照组(P<0.05)。(3)关节局部组织蛋白检测发现,与对照组相比,CCK-8处理显著降低关节局部促炎细胞因子(IL-17, IL-23, IL-6和TNF-α)和趋化因子(MCP-1)水平(P<0.05);上调IFN-γ和TGF-β水平(P<0.05);对IL-4和IL-10的水平变化无明显影响(P>0.05)。(4)小鼠血清中抗CII特异性抗体检测结果显示,与对照组相比,CCK-8处理显著降低CIA小鼠血清中抗CII特异性抗体IgG的含量(P <0.05),特别是显著降低IgG2a的含量(P <0.05),而对IgG1的水平无明显影响(P >0.05)。(5) CCK-8体外作用CIA小鼠膝关节滑膜组织细胞后,与体内结果一致可显著抑制滑膜组织细胞分泌促炎细胞因子(IL-17, IL-23, IL-6和TNF-α)和趋化因子(MCP-1) (P <0.05),促进其分泌IFN-γ和TGF-β(P <0.05),对IL-4和IL-10的产生无明显影响(P >0.05)。以上结果表明:CCK-8能有效抑制CIA发病,降低发病率、推迟发病时间、降低关节病理损伤程度。CCK-8发挥作用的机制主要与其抑制抗原特异性Th17细胞介导的自身免疫反应和炎症反应有关。结论本研究系统分析了CCK-8体内外作用对DC功能的影响及其对抗原特异性CD4+T细胞活化和分化的调节作用,在此基础上观察了CCK-8对CIA发病和关节病变的影响。得出以下结论:1 CCK-8体外作用通过调节DC成熟过程中的细胞表型和细胞因子分泌对抗原特异性CD4+T细胞的增殖和分化发挥调节作用。通过上调IL-12的产生促进Th1细胞分化,下调IL-6和IL-23的产生抑制Th17细胞分化和扩增。2 CCK-8体内作用CIA小鼠同样能够下调DC表面CD80、CD86和MHCII的表达,抑制IL-6和IL-23 p19 mRNA表达,促进IL-12 p35和p40 mRNA表达,抑制CD4+T细胞向Th17细胞分化,促进其向Th1和Treg细胞分化。3 CCK-8能有效抑制CIA发病,降低发病率、推迟发病时间、降低关节病理损伤程度。总之,CCK-8腹腔注射CIA小鼠可有效抑制发病,降低发病率、减轻关节病理损伤。CCK-8可通过多靶点发挥作用,其中最主要的途径是通过调节DC细胞表型和细胞因子分泌抑制抗原特异性Th17细胞介导的自身免疫反应和炎症反应。本研究为合理评价CCK-8对RA治疗的潜在价值提供了重要的动物实验和理论依据。