茶树(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)属于山茶科山茶属,是一种多年生常绿木本植物。茶树鲜叶是非酒精饮料加工中重要的原材料。茶叶中富含了多种人体有益的次生代谢物质,如茶多酚(尤其是儿茶素)、茶氨酸和咖啡碱。这些在茶叶中特异积累的代谢物质可以有效清除自由基,预防癌症、心血管病和神经病变,缓解疲劳和增强免疫力。茶叶中功能物质的含量与茶叶质量和保健功效相关。研究发现,茶叶中特异代谢产物的生物合成受到了茶叶发育阶段和季节气候等因素的影响。在植物中,叶发育和内含物质代谢受到了复杂的分子调控。叶形态建成从顶端分生组织(SAM)的细胞分裂和分化开始,经过叶原基的形成、叶的极性生长和叶形态大小调控等连续的发育过程。叶生长发育受到众多基因在转录、转录后和蛋白水平等多方面的调控。研究发现,部分基因同时参与到了叶形态建成和内含物质的形成中。这说明叶发育和内含物质代谢在一个分子网络中受到了统一而精确的调控。本研究以茶树品种’龙井43’为材料,鉴定了用于茶树叶不同发育阶段(第一叶、第二叶、第三叶、第四叶和老叶)中基因定量表达的内参基因。通过高通量测序方法初步解析这五个发育阶段茶树叶的miRNAs,并且揭示了 miRNAs在茶树叶发育中的调控作用。此外,基于同源性分析,利用茶树转录组数据鉴定了三个叶发育相关家族基因,即,GRF、GIF和TCP家族。本文为茶树叶形态结构建成和内含物质形成关联性提供了分子机制的研究基础。茶树叶的采摘加工涉及到农产品采后加工的科学研究领域。鲜片采后到叶细胞死亡中间存在一个与细胞自然衰老相似的生理过程。农作物的采后储藏技术总是在延长这样的衰老过程以提高货架期。在茶叶的加工中,则充分利用了叶采后变化的过程。通过一定的温度、湿度和光照条件,使茶叶水分部分散失、蛋白酶和水解酶等酶活性增强、内含物质发生有益的转化,从而利于茶叶做形和提升千茶感官品质,这样的加工工艺叫做萎凋。茶叶萎凋是通过人工控制采后茶树叶内生理、生化和分子的变化,以促进成品茶叶形成有益香气、滋味和颜色的过程。在许多茶类的加工中,如白茶、红茶和乌龙茶,萎凋工艺是茶叶加工的第一道工序。在萎凋工艺中,萎凋时间、温湿度条件和光照条件等因素影响了茶叶品质的形成,从而影响了干茶最终的感官审评品质。本研究通过iTRAQ技术,调查了茶叶在三种萎凋处理中(即,不同时间、不同温度和遮荫/光照萎凋处理)蛋白质组的变化,从蛋白水平上揭示了萎凋处理对茶叶生理生化的影响。主要研究结果如下:1.利用高通量测序技术构建了 ’云南十里香’、’槎湾三号’、’汝城毛叶茶’和’安吉白茶’四个茶树品种叶转录组数据库。总共获得了 146,342个unigenes,为后续茶树叶发育分子机制的研究提供了数据支持。Unigenes功能注释到Nt、Nr、GO、KEGG、COG和UniProtKB数据库,鉴定了 150个unigenes编码18种酶参与到了儿茶素的生物合成中。利用RP-HPLC检测了四个茶树品种中C、GC、EC和EGC的含量。利用qRT-PCR检测了儿茶素合成的三种关键酶基因(ANR、ANS和LAR)的表达。通过对比发现,三种关键酶基因的表达可能影响了儿茶素在不同茶树品种间含量的差异。2.基于与拟南芥的同源分析,从茶树转录组中鉴定了 9个内参基因(即,CsACT7、CsEF-1α、CseIF-4α、CsGAPDH、CsPP2A、CsSAND、CsTBP、CsTIP4I 和 CsTUB)。从茶树品种’龙井43’叶中克隆得到这9个内参基因的序列。利用qRT-PCR定量检测了内参基因在茶树叶五个发育阶段中(第一叶、第二叶、第三叶、第四叶和老叶)和响应五种激素处理(ABA、GA3、IAA、MeJA和SA)的表达。基于Cq值,利用常用的geNorm、NormFinder和BestKeeper三种软件计算和评估了 9个内参基因表达的稳定性。结果显示,CsTBP和CsTIP41基因在叶发育中是最适合的内参基因,CsTBP基因在不同激素处理中是最好的内参基因,CsTBP和CsTIP41基因在总样本中是最佳内参基因。CsNAM基因定量检验显示,三种软件计算结果可靠,即,越稳定的内参基因获得了越可靠的换算结果。3.叶在茶树中是进行光合作用和主要次生代谢产物形成的器官。通过树脂和显微镜观察,获得了茶树品种’龙井43’叶五个发育阶段(第一叶、第二叶、第三叶、第四叶和老叶)的微观结构。通过LI-6400XT便携式光合作用系统观察了茶树叶五个发育阶段的光合特征(即,净光合速率、气孔导度、细胞间CO2和蒸腾速率)。叶结构特征和光合特征显示,茶树叶发育是一个形态结构和生理特征连续性变化的过程。第三叶和第四叶可能是主要的功能叶。利用高通量测序技术对茶树品种’龙井43’五个发育阶段叶进行了小RNA测序。基于其他物种miRNA数据库和茶树转录组数据,总共鉴定得到111个保守的miRNAs和68个新的miRNAs。总共155个miRNAs预测到1,379个靶基因。功能注释显示,具有GO分子功能“结合”术语的靶基因最多。表明茶树中miRNA的靶基因可能在转录调控中发挥着重要作用。从靶基因中共获得50个靶基因编码了转录因子。与转录因子转录本具有互补性的miRNAs通常是保守的miRNAs,这表明miRNAs在植物的调控中具有高度的保守性。我们鉴定了许多的miRNAs与靶基因形成上下游调控关系,参与了叶形态建成的过程。4.基于同源性分析,从茶树转录组中鉴定得到6个GRF和2个GIF基因。序列比对显示,茶树CsGRF和CsGIF蛋白与拟南芥和水稻同源蛋白具有高度的一致性。基序分析显示,茶树CsGRF蛋白具有QLQ、WRC、FFD、TQL和GGPL五个保守的基序。QLQ可能具有与CsGIF蛋白互作的结合功能,而WRC可能具有核定位功能。茶树CsGIF蛋白具有保守的SNH结构域,可能与CsGRF蛋白的QLQ结构具有互作关系。miRNA靶位点预测显示,CsGRF转录本编码WRC保守域的一段序列存在miR396的靶位点。CsGRF和CsGIF蛋白互作和CsGRF-miR396可能共同调控了叶的发育。定量表达显示,茶树CsGRF和CsGIF基因参与到了叶的发育(第一叶、第二叶、第三叶、第四叶和老叶)和对激素的响应(ABA、GA3、IAA、MeJA和SA)。茶树CsGRF基因随叶发育表达逐渐降低,表明CsGRF基因可能在叶发育早期具有重要的作用。此外,基于同源性分析,从茶树转录组中鉴定得到17个TCP家族基因。茶树CsTCP蛋白的TCP保守域与拟南芥和水稻中该结构域存在高度相似性。茶树CsTCP蛋白的TCP保守域可能具有核定位和蛋白互作功能。亚细胞定位显示,CsTCP15蛋白定位在洋葱表皮细胞的细胞核上。这表明CsTCP15蛋白具有核定位功能,可能通过核定位转录调控了下游基因。miRNA靶位点预测显示,CsTCP15转录本编码蛋白的C端存在miR319的靶位点。表明miR319可能通过调节CsTCP15基因的转录后水平来调控叶发育。定量表达显示,茶树CsTCP基因参与到了叶的发育(第一叶、第二叶、第三叶、第四叶和老叶)和对激素的响应(ABA、GA3、IAA、MeJA和SA)。通过整合了系统进化树关系和表达聚类分析显示,CsTCP7-CsTCP8和CsTCP11-CsTCP12-CsTCP14可能是功能冗余基因对。5.基于iTRAQ技术,我们调查了以下三种茶叶萎凋处理的蛋白质组:不同时间,即,Oh(CK)、1h(S1)、4h(S2)和12h(S3)茶叶萎凋;不同温度,即,常温(25℃,RT)、高温(38℃,HT)和低温(4℃,LT)萎凋处理4h;遮荫/光照处理,即,光照1 h(G1)、光照4 h(G2)、遮荫1 h(Z1)和遮荫4 h(Z2)处理。三组结果总共获得了 2,486个蛋白。在不同时间萎凋处理中,共获得了 863个DEPs(S1/CK、S2/CK和S3/CK)。通过GO、KEGG和PPI功能注释和蛋白互作分析显示,DEPs参与了茶树叶在采后中细胞衰老的调控,抑制了初级代谢和调控了次生代谢途径。在不同温度萎凋处理中,共获得了 787个DEPs(HT/RT和LT/RT)。通过GO、KEGG和PPI功能注释和蛋白互作分析显示,DEPs参与了对极限温度的响应、茶叶特有化合物的合成、内源性激素的调控和细胞发育的抑制。在遮荫/光照萎凋处理中,共获得了 863个DEPs(Z1/G1和Z2/G2)。通过GO、KEGG和PPI功能注释和蛋白互作分析显示,DEPs参与了光合作用和光合固碳以及茶叶次级代谢产物的形成。在茶叶萎凋工艺中,不同时间、不同温度和遮荫/光照处理引起了采后茶叶不同的应激反应。DEPs在短时间内通过调控各类代谢途径,促使茶叶内含物质的降解或合成,从而影响了茶叶最终的颜色、香气和滋味。