论文部分内容阅读
端粒酶(Telomerase)是真核细胞中的一种核糖核蛋白复合体,由端粒酶RNA组分(Telomerase RNA,TR)和端粒酶催化亚基(Telomerase Reverse Transcriptase,TERT)组成,是一种特殊的DNA聚合酶,具有延伸DNA末端的功能,能够维持端粒的长度和功能,TR为端粒的合成提供模板,TERT具有反转录酶活性。在大多数体细胞和原代细胞中,无端粒酶活性或活性很低,但在肿瘤细胞中,端粒酶活性却被激活,这是维持细胞分裂及克服端粒序列不断丢失所必须的。本研究对鸡端粒酶(chicken TERT,chTERT)活性中心进行预测定位、克隆测序以及生物信息学分析,拟在探讨MD肿瘤发生与端粒及端粒酶的关系,从而为病毒性肿瘤发生的机制提供实验依据。
通过chTERT全序列与人hTERT(human TERT,hTERT)活性中心序列的序列比对和同源性分析,结果表明,鸡原肠胚期细胞(Gastrula Stage Cell,GSC)chTERT保守区序列位于chTERT序列全长的2013bp-3825bp处,全长1813bp,chTERT序列包括反转录基序1、2、A、B、C、D、E;chTERT活性中心区域位于保守区2301bp-3825bp,全长1525bp。采用RT-PCR技术,分别对GSC和鸡马立克氏病淋巴样瘤细胞系MDCC-MSB1(Marek’s Disease Virus Trarlsformed Chickerl Lymphoblastoid Cells-MSB1 line)chTERT保守区序列进行了克隆与序列分析。结果表明,GSC的chTERT包括活性中心的保守区序列,全长1813bp(NCBI收录号EF552224);MDCC-MSB1的chTERT包括活性中心的保守区序列,全长1543bp(NCBI收录号EF552225),但在MDCC-MSBl的chTERT保守区序列中与GSC的chTERT保守区序列比对,出现两部分的缺失现象,缺失A位置位于保守区全长1813bp的612bp-791bp,长度180bp;缺失B位置位于1053bp-1134bp,长度82bp。
根据获得的鸡端粒酶催化亚基保守区序列的信息,利用生物信息学方法,应用ExPASy与NCBI等系统中的生物信息学分析工具,对鸡端粒酶催化亚基保守区进行生物信息学分析。分析和预测结果获得如下目的基因的氨基酸序列及其各项理化参数,包括分子量、等电点、氨基酸组成及电荷分布等。二级结构如α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲等结构预测结果显示,各结构单元在氨基酸序列中的分布,这些结果对chTERT活性中心的结构与生物学功能的研究提供参考。
利用多重序列比对工具,对chTERT与不同物种的来源的动物TERT进行了同源性分析,结果显示它们之间核苷酸的同源性不高,但氨基酸序列间的比对结果显示有较高的同源性,在酶的活性中心部位,氨基酸序列有相似反转录酶(Reverse Transcriptase,RT)基序,存在着保守序列。利用BLAST比对工具,对克隆片段的缺失部分进行了生物信息学分析,结果显示缺失导致了TERT反转录基序的不完整,缺失A恰好在motif2和motif A的位置上各占有一部分,缺失B位于motif A和motif B之间。在MDCC-MSB1的chTERT保守区1282bp处有一个碱基缺失,可能会导致移码突变,在1697bp和327bp处出现SNP,由于此变化可能会导致结构与功能的变化,因此,与RT motif相关的功能可能会受到严重的影响,进而影响了端粒酶的活性。