第一部分:类CAR多价适配体的构建及其激活T淋巴细胞并靶向杀伤肺癌细胞的初步应用近年来,免疫疗法在肿瘤疾病的治疗中越来越凸显其重要的地位,例如单克隆抗体,免疫佐剂,肿瘤疫苗以及CAR-T治疗等。其中最有潜力的治疗方法莫过于CAR-T治疗,其CARs系统的多变性以及适应性,使得此疗法获得越来越多的青睐。同时,适配体拥有很多与抗体类似的性质,近几年在肿瘤的免疫疗法中也倍受关注。本研究以靶向免疫分子的多种适配体为主体,构建了一个类CAR多价适配体,能发挥CARs系统激活T细胞、靶向肿瘤细胞的作用,从而作为一种多价功能化的核酸药物制剂,能够与T细胞一起实现类似CAR-T的作用,发挥杀伤肿瘤细胞的功能。通过文献调研,我们选取了两个已经报道并证实,分别与小鼠CD28和CTLA-4这两个免疫靶点结合的RNA适配体——CD28Apt7与Del60,前者作为T细胞的激活适配体,提供细胞免疫的第二信号促进T细胞的增殖;后者可以阻断T细胞的无能通路,封闭肿瘤细胞表面免疫检查点配体对T细胞免疫抑制。我们根据碱基互补配对的原则,在一个相对稳定的核酸骨架序列上,通过退火搭接的方法组装上CD28适配体的二聚体和CTLA-4适配体的四聚体。同时在骨架上标记叶酸,以靶向上皮来源的肿瘤细胞,整个聚体结构称为X聚体。EMSA方法和SPR方法证明CD28Apt7和Del60分别可以与小鼠CD28蛋白和CTLA-4蛋白结合,同时组装好的X聚可以同时与小鼠CD28和CTLA-4蛋白结合。CFSE增殖实验证实,X聚体可以刺激T细胞增殖。同时X聚体可起到封闭B7.1分子对CTLA4靶点的作用,ELISA证实X聚体能够逆转B7.1分子对T细胞上清的IL-2的分泌抑制作用。共聚焦以及流式细胞仪实验均证实X聚体不仅结合T细胞,还能靶向H460肺癌细胞。体外肿瘤细胞与T淋巴细胞混合培养,加入的X聚体可以有效激活T细胞,使T细胞增殖并杀伤H460肺癌细胞。本研究首次证实具有类CAR作用的多价适配体聚合物可以作为化学药物通过激活T淋巴细胞发挥CAT-T样作用。我们的研究结果将会为肿瘤的免疫治疗提供一种新的思路。第二部分:H1N1甲流病毒特异性适配体的筛选与鉴定利用SELEX技术,以H1N1型灭活的甲流病毒颗粒为靶标,以灭活的乙流病毒颗粒为削减靶标,筛选与H1N1病毒的特异性结合的适配体。第6轮时文库得到有效富集,随后经过挑克隆测序获得了9条富集序列,经过对9条序列的结合力比较,选出结合力较好的A8和A20两条序列进行重点研究。结合实验证实,A8和A20识别甲型流感病毒H3N2亚型,不识别H7N9亚型,乙型流感病毒、以及副流感病毒1、2、3型。我们通过软件分析二级结构,将A8、A20两条序列进行不同程度的截短,及相应的亲和力测定,发现A8S8和A20S两条截短序列亲和力最高并达到了nM级(Kd,_A8S8=4.746±2.86/Kd,_A20S=5.559±4.141 nM)。随后,以A8S8序列为捕获适配体,A20S序列为检测适配体建立了双适配体夹心（sandwich ELONA）检测H1N1的方法,检测下限达到0.3ng/μL。因此,我们筛选出了特异性结合H1N1型甲流病毒的适配体,建立了一种以完整病毒颗粒为靶标的筛选方法,为后续对于安全、快速、低成本、高灵敏度的检测病毒方法的建立奠定了基础。